胃癌组织中miR-760、BST2的表达变化及意义

蔡永昌，李瑞平

东莞市人民医院，广东东莞 523000

胃癌是威胁全球人类健康的常见恶性肿瘤之一，每年胃癌的病死率约为10%［1］。幽门螺杆菌感染、饮食结构的改变是罹患胃癌的危险因素［2］。胃癌早期临床症状不明显，部分患者发现时已是晚期，多伴有转移及周围组织浸润，经治疗后易复发且预后差，5 年生存率低于 30%［3］。因此，有必要探索诊断胃癌的新的有效生物标志物。微小RNA（miR⁃NA）长度约为22 个核苷酸，是小的单链非编码RNA，与靶mRNA 的3"非翻译区（UTR）结合，进而调节基因表达［4］。有研究表明，miR-760在多种肿瘤组织中表达呈异常状态，如肺癌、乳腺癌［5-6］，通过影响肿瘤细胞的增殖、凋亡及侵袭能力进而调节肿瘤的发生发展。骨髓基质细胞抗原2（BST2）是一种Ⅱ型跨膜蛋白，也称为Tetherin、CD317。BST2 广泛表达于骨髓基质细胞、B 细胞、T 细胞及 NK 细胞等［7］。有研究报道，BST2在其他免疫细胞和恶性细胞中也有表达，包括B 细胞慢性淋巴白血病细胞［7］、肺癌细胞［8］。越来越多研究表明，BST2 可调节多种肿瘤的发生发展，如乳腺癌、口腔鳞状细胞癌［9］。本研究通过检测胃癌组织中miR-760 和BST2 mRNA 的相对表达量来分析两者与临床病理参数之间的关系，探讨两指标在胃癌发生发展过程中的作用及意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取 2018 年 6 月—2019 年 5 月于我院住院治疗的胃癌患者82例。纳入标准：均经活检或术后病理检查明确诊断为胃癌；均为首次诊断胃癌，从未做过放疗或化疗治疗；临床病理资料完整并接受随访，且均通过患者及家属的同意并签署知情同意书。排除标准：患有其他消化系统疾病，如胃炎、胃溃疡等；患有其他系统疾病或者恶性肿瘤，如食管癌、乳腺癌等；患有免疫功能缺陷疾病。82 例患者，男 56 例，女 26 例；年龄 41～69（55.31 ± 2.2）岁；≥55 岁 37 例，<55 岁 45 例；根据胃癌病理组织分化结果，中低分化 51 例、高分化 31 例；TNM 分期：Ⅰ期42例，Ⅱ期27例，Ⅲ期8例，Ⅳ期5例；有淋巴结转移 40 例；肿瘤直径<2.5 cm 38 例，≥2.5 cm 44 例。TNM 分期及病理分化程度参考第八版美国癌症联合会标准［10］。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 组织中miR-760 和BST2 mRNA 检测 采用荧光实时定量PCR 技术。收集活检或术中获取的胃癌组织及癌旁组织（距肿瘤组织边缘≥5 cm），应用TRIzol 法提取总RNA（RNA 提取试剂盒购自上海生工生物工程有限公司），使用紫外分光光度仪检测RNA 浓度，符合标准的RNA 冻存备用。使用RNA 逆转录试剂盒（购自日本TaKaRa 公司）将提取出的RNA 进行反转录成cDNA，反转录条件：25 ℃ 10 min，50 ℃ 45 min，85 ℃ 5 min。以 cDNA 为模板，使用PCR扩增试剂盒（上海生工生物工程有限公司）进行PCR扩增，所有引物由上海生工生物工程有限公司合成。miR-760 F：5"-TCTGGGTCTGT⁃GGGGAGTTG-3"，R：5"-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3"；内参GAPDH F：5"-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3"，R：5"-CAAAGTTGTCATGGATGATCC-3"；BST2mRNA F：5"-TGTCGCAATGTCACCCATCT-3"，R：5"-CTTCTCAGTCGCTCCACCTC-3"；内参U6 F：5"-GAG⁃GCACAGCGGAACG-3"，R：5"-CTACCACATAGTC⁃CAGG-3"。反应体系：10 µL 2×SYBR Green，1 µL 20×TaqDNA 聚合酶，0.5 µL 上下游引物和 8 µL H2O。qPCR 反应条件：95 ℃ 预变性 5 min，55 ℃ 变性1 min，72 ℃延伸10 s，共40 个循环。每个样本至少重复3次试验，最后采集荧光信号，以2-ΔΔCt法计算miR-760和BST2 mRNA的相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。计量资料以-x±s表示，两组间比较采用两独立样本t检验，相关性分析采用Pearson 线性相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织与癌旁组织中miR-760、BST2 mRNA表达比较 miR-760 在胃癌及癌旁组织中的相对表达量分别为 0.023 ± 0.008、0.031 ± 0.010，两者相比P<0.01。BST2 mRNA 在胃癌及癌旁组织中的相对表达量分别为 0.034 ± 0.011、0.017 ± 0.007，两者相比P<0.01。

2.2 胃癌组织中miR-760、BST2 mRNA 的表达与患者临床病理参数的关系 见表1。

表1 胃癌组织中miR-760、BST2 mRNA的表达与患者临床病理参数的关系

2.3 胃癌组织中miR-760 和BST2 mRNA 表达的关系 胃癌组织中miR-760 和BST2 mRNA 的表达呈负相关（r=-0.545，P<0.05）。

3 讨论

胃癌是最常见消化系统肿瘤之一，是世界上癌症相关死亡的第三大诱因［11］，在世界各国发病率也存在很大差异。食用含高盐或高硝酸盐食物、饮酒和吸烟是胃癌发生的主要危险因素［12］。除了遗传易感性之外，家族中有胃癌患者亦是高危因素之一。早期胃癌临床症状并不明显，不易引起重视，因此部分患者诊断时已是晚期，常伴有远处转移，治愈率低、易复发且预后差。因此，寻找有意义的胃癌生物学指标是医疗工作者一大重要任务。

miRNA 是一类小的非编码单链RNA，在多种肿瘤细胞中均表达，如乳腺癌、结肠癌等［11］，通过调节癌细胞的增殖、分化迁移过程，进而参与肿瘤的发生发展。近年来研究表明，miRNA 在胃癌中常呈异常表达状态，如miR-532 在胃癌中表达上调，通过激活Wnt/β-catenin信号通路，促进了细胞增殖、迁移及浸润过程［13］。miR-760亦是miRNA的一种，miR-760在卵巢癌表达上调，并通过下调PH 域富含亮氨酸重复蛋白磷酸酶2的表达进而促进卵巢癌细胞的增殖分化过程［14］。但是miR-760 在胃癌中的作用机制尚不明确。本研究结果显示，胃癌组织中miR-760 的相对表达量低于癌旁组织，且肿瘤TNM 分期越高、细胞分化程度越低或发生淋巴结转移时，胃癌组织中miR-760表达水平越低，说明了miR-760的表达水平与肿瘤TNM 分期、细胞分化程度及淋巴结转移有关。有文献显示，过表达的miR-760 可通过下调下游靶基因ROS1 的表达进而抑制癌细胞的增殖分化及迁移，停滞肿瘤细胞的生长周期［15］；CAO 等［16］研究发现，过表达的miR-760 可靶向抑制重组人碱性亮氨酸拉链转录因子ATF 样蛋白3/激活子蛋白1 信号通路，进而影响抑制靶基因cyclinD1的表达，从而实现抑制肿瘤细胞生长、迁移的作用。而当组织中miR-760 表达减少时，其抑制肿瘤细胞增殖的功能减弱，间接的对肿瘤细胞的生长分化起促进作用，促进肿瘤的恶性进展。此外，miR-760 还可抑制其另一靶基因细胞因子信号转导抑制因子3（SOCS-3）的表达，进一步下调SOCS3 的抑制肿瘤细胞增殖的作用，在一定程度上实现了促进肿瘤细胞的增殖分化及淋巴结转移的作用，提高了肿瘤的临床分期，增加了肿瘤的恶性程度，给临床治疗带来了极大挑战［17］。

BST2 是由180 个氨基酸组成的单次Ⅱ型跨膜蛋白，相对分子质量为35 kD，其基因位于染色体19p13.2。BST2 主要由四部分组成，分别为N 端、C端、跨膜区及胞外螺旋区［18］。BST2具有多种生物学功能，如调节B 细胞的生长、抑制人类免疫缺陷病毒1 的复制及抑制不同种包膜病毒，如埃博拉病毒和单纯疱疹病毒从细胞释放的过程［19］。相关研究表明，BST2参与多种癌症的发生发展，如口腔癌、乳腺癌及子宫内膜癌等［20］。但是BST2 在胃癌中的分子作用机制还尚不清楚。本研究结果显示，胃癌组织中BST2 mRNA 的相对表达量高于癌旁组织。原因可能为：BST2 是 miR-760 的靶基因之一，miR-760 可与BST2 结合从而下调BST2 的表达，当胃癌组织中miR-760 表达降低时，其下调BST2 表达的功能降低，使得癌组织中BST2的表达提高［21］。本研究结果还显示，BST2 mRNA 的相对表达量与肿瘤细胞分化程度、TNM 分期及淋巴结转移有关。BST2核酸序列中有与转录激活因子3（STAT3）的结合位点，当STAT3 与 BST2 结合时，激活了 BST2 的表达，促进肿瘤细胞的增殖、迁移和转移等过程，从而在肿瘤的发生发展中起到促进作用，提高了肿瘤的临床分期与恶性程度［18］。另一方面，过表达的BST2可抑制核转录因子信号通路，促进磷酸化IκBα 和p65 的表达，促进肿瘤细胞的生长，并上调抗凋亡基因的表达，抑制肿瘤细胞的凋亡过程，从而对肿瘤的发生、侵袭和转移发挥重要作用［22］。BST2 还可通过激活基质金属蛋白酶2的表达进而促进癌细胞的生长和运动过程，进一步促进肿瘤细胞的迁移进而侵袭［23］。

本研究胃癌组织中miR-760 与BST2 的表达呈负相关，原因可能是BST2 是miR-760 的靶基因，高表达的miR-760 可以抑制肿瘤细胞的生长，BST2 具有促进肿瘤发生发展的作用，两者共同在肿瘤的生长过程中发挥了重要作用。

综上所述，胃癌组织中miR-760 表达降低，BST2 mRNA 表达升高，两者均与肿瘤TNM 分期、肿瘤细胞分化程度及淋巴结转移有关，有望在胃癌诊断、治疗及预后评估中发挥重要作用。但两者在胃癌发生发展过程中的具体作用机制还需要大样本多中心的研究深入探讨。