结肠癌组织中lncRNA XIST、miR-32-5p、EZH2的表达变化及临床意义

李文强，李爱杰，张云，岳金波

1 潍坊医学院临床学院，山东潍坊261053；2 山东省肿瘤医院

结肠癌是常见的恶性肿瘤，世界每年发病患者例数约110万，我国结肠癌发病率不断升高，并且有年轻化的趋势［1-2］。目前结肠癌的发病机制还未阐明，可能与遗传因素、饮食结构、经济状况等有关。因此，探究结肠癌的致病因素对疾病预防及早期筛查意义重大。非编码RNA 是无蛋白编码功能的RNA 分子，近年来研究表明，其在调控基因表达、染色质重构等过程中发挥重要的调节作用，与炎症、免疫及癌变的发生发展有关［3］。长链非编码RNA（ln⁃cRNA）X 染色体失活特异性转录本基因（XIST），位于Xq13.2，该基因是X 染色体上失活中心区域中第一个鉴定出的非编码基因，对X 染色体失活的启动和维持至关重要。研究表明，lncRNA XIST 在多种肿瘤中异常表达，并影响肿瘤细胞的增殖及转移等恶性生物学行为［4-5］。微小 RNA（miR）-32-5p 位于9q31.3，可调控多条细胞信号传导通路，其作为一种抑癌基因，在非小细胞肺癌［6］、口腔鳞癌［7］等恶性肿瘤中表达失调，促进肿瘤的恶性进展。基因增强子的人类同源基因（EZH2）位于7q36.1，该基因编码蛋白是多梳蛋白PcG 家族成员之一，具有多梳抑制复合物2（PRC2）的催化亚基，参与维持基因表达的调控，在细胞分裂增殖、染色体重构及肿瘤发生等生理病理过程中起重要的调节作用［8］。有学者在结直肠癌HCT-8 肿瘤细胞中发现，lncRNA XIST 通过抑制miR-32-5p 的表达，促进EZH2 的表达，促进HCT-8细胞的增殖及迁移等恶性生物学行为［9］。本研究观察了结肠癌组织中lncRNA XIST、miR-32-5p 及EZH2的表达变化，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集 2018 年 8 月—2019 年 8 月于山东省肿瘤医院诊治的86 例结肠癌患者的临床病理资料。纳入标准：患者均经组织病理学检查明确；患者均为首次诊治，无放化疗治疗史；住院期间相关检查及病理资料完整，患者已签署知情同意书。排除标准：伴肠道急慢性感染性疾病；既往罹患恶性肿瘤病史；伴心肺肝肾功能障碍。结肠癌患者中男51例，女35例；年龄27～78（52.4 ± 7.1）岁；肿瘤位置：直肠31 例，结肠55 例；伴淋巴结转移20 例，无淋巴结转移 66 例；肿瘤直径：≤3 cm 者 60 例，>3 cm 者 26例；肿瘤分期：Ⅰ期 23 例，Ⅱ期 33 例，Ⅲ期 24 例，Ⅳ期6 例；肿瘤分化程度：高分化26 例，中分化28 例，低分化32例。本研究经本院伦理委员会审核通过。

1.2 组织中 lncRNA XIST、miR-32-5p 及 EZH2 检测 各取癌组织及癌旁组织（距离癌组织5 cm 以上）约50 mg，剪碎后研钵中加液氮研磨，加入1 mL TRIzol 后重悬，利用TRIzol 法提取癌组织及癌旁正常组织中的RNA。将获取的RNA 产物按照试剂盒说明书反转录为cDNA，分光光度计检测cDNA 浓度及 纯度 ，cDNA 的 OD260/OD280在 1.8～2.1。 lncRNA XIST 正向引物序列：5"-TTGGGGAACCACCTA⁃CACTTGAG-3"，反向引物序列：5"-CCATTTTGCTAT⁃GCGTTATCTGA-3"；EZH2 正向引物序列：5"-CCCT⁃GACCTCTGTCTTACTTGTGGA-3"，反向引物序列：5′-ACGTCAGATGGTGCCAGCAATA-3′；内参基因GAPDH 正向引物序列：5"-ACAGCCTCAAGATCAT⁃CAGC-3"，反向引物序列：5"-GGTCATGAGTCCTTC⁃CACGAT-3"；miR-32-5p 上游引物序列：5"-ACACTC⁃CAGCTGGGTACAGTATAGATGATGTACT-3"，下 游引物序列：5"-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3"；内参基因U6 上游引物序列：5"-CTCGCTTCGGCAGCACA-3"，下游引物序列：5"-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3"。总反应体系20 µL，其中Master Mix 10 µL，上游及下游引物各1 µL，模板cDNA 1 µL，RNA-free 水8µL。LncRNA XIST 及 EZH2 反应条件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 20 s，共40 个循环。miR-32-5p 反应条件：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共 50 个循环。采用 2-ΔΔCt法计算 lncRNA XIST、miR-32-5p及EZH2的相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。计量资料采用-x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验；各指标相关性用Pearson 线性相关进行分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌与癌旁组织中lncRNA XIST、miR-32-5p及 EZH2 表达比较 lncRNA XIST、miR-32-5p 及EZH2 在结肠癌组织中相对表达量分别为2.172 ±0.243、0.544 ± 0.085、1.283 ± 0.212，在癌旁组织中分别为 1.079 ± 0.084、1.651 ± 0.122、0.479 ±0.110，癌组织中 lncRNA XIST、EZH2 相对表达量高于癌旁组织（t=39.423、31.218，P均<0.01），miR-32-5p低于癌旁组织（t=69.042，P<0.01）。

2.2 结肠癌组织中lncRNA XIST、miR-32-5p 及EZH2 表达与患者临床病理特征的关系 癌组织中lncRNA XIST、miR-32-5p 及 EZH2 表达与肿瘤分期有关（P均<0.05），见表1。

2.3 结肠癌组织中lncRNA XIST、miR-32-5p 及EZH2 表达的相关性 结肠癌组织中lncRNA XIST与 miR-32-5p 呈负相关（r=–0.612，P<0.01），miR-32-5p 的相对表达量与EZH2 的相对表达量呈负相关（r=–0.608，P<0.01），而lncRNA XIST与EZH2的相对表达量无明显相关性（r=0.375，P=0.284）。

3 讨论

结肠癌是我国常见的消化系统恶性肿瘤，发病率在恶性肿瘤中排第三［10］。结肠癌的治疗包括手术治疗、放化疗及生物靶向治疗等。早期患者首选手术治疗，但晚期转移患者即使经积极综合治疗仍预后不佳。因此，需深入研究结肠癌的病因及发病机制，寻找新的诊断治疗靶点［11］。结肠癌的发病与遗传因素、环境因素、饮食因素及肠道疾病等有关，各种因素综合作用，促进肠黏膜上皮细胞中癌基因的表达，导致细胞的恶性转化。近年来研究发现，ln⁃cRNA、miRNA 等在肿瘤的发生发展中发挥重要的作用，其可通过转录及转录后等机制调控下游癌基因的表达，促进肿瘤细胞增殖及转移、抑制凋亡等，有助于肿瘤诊断及治疗［12］。

lncRNA 是长度大于200 个核苷酸的非编码RNA。研究表明，lncRNA 在炎症、自身免疫及肿瘤等多种疾病中均发挥重要的调控作用，lncRNA 的异常表达影响疾病的发生发展［13］。lncRNA XIST 结构上具有X 染色体灭活中心域，是近年来发现的参与调控哺乳动物雌性早期发育过程X染色体失活的非编码RNA。近年来发现，口腔鳞癌［4］、胃癌［5］等多种肿瘤中lncRNA XIST 表达升高，其通过表观遗传学调控下游上皮间质转化基因如E-钙黏素、N-钙黏素等的表达，促进肿瘤的恶性增殖、浸润和转移［14］。本研究中，结肠癌组织中lncRNA XIST 表达升高，可能与调控其表达的上游分子异常有关。多数长非编码基因由RNA 聚合酶Ⅱ转录，并且具有组织和时间的特异性，肿瘤发生时某些因子如lncRNA增强子相关因子，能够促进RNA 聚合酶Ⅱ结合到lncRNA XIST基因启动子区域，导致 lncRNA XIST 表达升高［15］。此外，lncRNA XIST 表达与肿瘤分期有关，其原因可能是lncRNA XIST 的过表达能够通过分子海绵抑制miR-137 的表达，进而导致notch1 的过度激活，促进上皮间质转化过程的关键转录因子Snail的表达，降低肿瘤细胞之间上皮性标志E-钙黏素表达，而升高间质性表型如N-钙黏素、波形蛋白等的表达，增强肿瘤的浸润及转移能力［16］。miRNA 是长度为19～25 个核苷酸RNA 分子，可构成RNA 诱导的沉默复合物（RISC），RISC 结合靶基因mRNA 的3"非编码区（UTR），通过影响mRNA 进而达到调控基因的效果。miR-32-5p 是一种发挥肿瘤抑制功能的miRNA。研究表明，miR-32-5p 在非小细胞肺癌、结直肠癌等恶性肿瘤中表达降低，导致其下游癌基因ERBB2 转导子1 的表达增加，进而增强肿瘤细胞的增殖及浸润能力［6，17］。本研究中，结肠癌组织中 miR-32-5p 表达较癌旁组织低，其机制是miR-32-5p 的表达受ln⁃cRNA，如lncRNA GAS5 的表达调控。有研究表明，结直肠癌中lncRNA GAS5 的表达增加，而lncRNA GAS5 能作为分子海绵结合并抑制miR-32-5p 的表达，导致癌组织中 miR-32-5p 表达降低［18］；此外，结肠癌高肿瘤分期患者miR-32-5p 表达低于低分期患者，提示miR-32-5p 低表达促进结肠癌的疾病进展。研究发现，miR-32-5p 能结合转录因子Kruppel 样因子 4（KLF4）mRNA 的 3"UTR，促进 KLF4 mRNA 的降解，抑制KLF4 的表达。但肿瘤发生时，肿瘤细胞中miR-32-5p 表达降低，导致KLF4 的表达升高，而KLF4促进细胞周期相关癌基因如周期素D1等的表达，导致肿瘤细胞增殖及转移能力增强［19］。

表1 结肠癌组织中lncRNA XIST、miR-32-5p及EZH2表达与患者临床病理特征的关系

EZH2 作为多梳蛋白家族成员之一，在胚胎发育的早期能够调控细胞的增殖及分化功能［20］。近年来有学者发现，EZH2 基因的持续激活能够促进细胞的恶性增殖及转化，可能是肿瘤重要的致癌基因。机制上，EZH2 参与构成组蛋白甲基转移酶，促进组蛋白赖氨酸甲基化，抑制多种P53 等抑癌基因的表达，促进肿瘤的进展［21］。我们的研究发现，癌组织中EZH2 表达上调，这可能与miRNA 对EZH2 的转录后调控有关。WANG 等［22］研究表明，结肠癌发生时抑制EZH2 表达的miRNA 如miR-600 表达降低，引起肿瘤中EZH2 的表达升高。此外，结肠癌中EZH2 的表达与肿瘤分期有关。可能原因是肿瘤发生时EZH2 的表达升高，引起组蛋白去乙酰化酶的活性降低、P53基因H3K27位点的甲基化水平增加，导致P53 基因的G2/M 期周期阻滞功能丧失、肿瘤细胞的增殖及浸润能力提高［23］。

本研究进一步分析结肠癌中lncRNA XIST、miR-32-5p 及EZH2 表达的相关性，结果显示ln⁃cRNA XIST 与 miR-32-5p 的表达呈负相关，miR-32-5p 与EZH2 的表达呈负相关，其机制可能是lncRNA XIST 能够作为分子海绵结合并抑制miR-32-5p 的表达，导致miR-32-5p 水平降低，而miR-32-5p 能够特异性结合并抑制EZH2的表达，即lncRNA XIST 能够通过miR-32-5p/EZH2 分子轴促进结肠癌肿瘤细胞的增殖及迁移［9］。

综上所述，结肠癌组织中lncRNA XIST 与EZH2表达上调，而miR-32-5p 表达下调，癌组织中ln⁃cRNA XIST、miR-32-5p 及 EZH2 表达与肿瘤分期有关，lncRNA XIST、miR-32-5p 及 EZH2 三者共同参与结肠癌的恶性进展。但三者的具体作用机制及临床应用价值仍需深入研究。