血清微小RNA-155 表达与溃疡性结肠炎患者病情严重程度及复发的关系

张凤，罗德兰，钟玉全

内江市第一人民医院，四川内江641000

溃疡性结肠炎（UC）是免疫相关的慢性非特异性肠道炎性病变，近年来随着我国人民生活水平的提高，发病率呈逐渐增加的趋势［1］。病因尚不明确，与遗传、环境及免疫等因素有关，表现为肠黏膜组织损伤及机体免疫功能紊乱［2］。目前UC的治疗主要包括激素治疗、手术治疗等，但部分UC患者存在激素治疗不敏感或激素抵抗的现象，导致治疗失败［3］。因此，研究炎症性肠病（IBD）的病因及发病机制，寻找UC患者预后的危险因素，对于控制UC患者症状发作、尽早应用免疫抑制剂转换治疗及提高患者生活质量具有重要的临床意义。微小RNA（miRNA）是长度为19～25个核苷酸的RNA分子，参与细胞分化、增殖、凋亡及衰老等生理过程。近年来研究发现，miRNA在炎症、免疫、肿瘤等多种疾病中均存在异常表达的现象，通过调控下游靶基因转录后水平的表达，发挥重要的生物学功能［4］。miR-155基因位于人类染色体21q12.3，是一种参与造血、炎症和免疫反应的多功能miRNA，其表达受炎症因子和toll样受体配体诱导［5］。研究表明，在IBD患者结肠黏膜中miR-155的表达异常升高，并通过调控下游转录因子Est-1，促进UC的发生发展［6］。但目前UC患者血清中miR-155表达及临床意义报道较少。本研究通过检测UC患者血清中的miR-155，分析其与UC病情严重程度及复发的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年1月—2017年12月我院诊治的97 例UC 患者（UC 组）。纳入标准：参考中华医学会消化病学分会IBD 学组制定的《炎性肠病诊断与治疗的共识意见》中UC 诊断标准进行诊断［7］；临床及随访资料完整；既往无激素类等药物治疗史。排除标准：合并心、肝、肺、肾等重要脏器功能障碍疾病；患精神障碍性等疾病；患胃肠道细菌性、病毒性感染及肠道结核等肠道疾病。UC 组患者年龄33～56（41.4 ± 5.6）岁；男50 例，女47 例；有吸烟史 57 例，无吸烟史40 例；体质量指数（BMI）18.2～27.4（21.3 ± 3.4）kg/m2；病情活动期 61 例，缓解期36例；病变范围：直肠及乙状结肠41例，左半结肠34例，全结肠22 例；伴肠外症状（包括关节疼痛、口腔病变等）28 例，无肠外症状69 例。以49 例查体健康人群作为对照组，其中男27 例，女22 例；年龄35～59（43.1 ± 6.1）岁；BMI 18.7～28.1（21.7 ± 4.1）kg/m2。UC组与对照组性别、年龄及BMI比较差异无统计学意义。所有患者签署知情同意书，本研究经本院伦理委员会审核批准通过。

1.2 血清中miR-155 表达检测 采用荧光定量PCR。留取各组清晨空腹静脉血5 mL，EDTA抗凝，4 ℃下2 500 r/min 离心10 min（离心半径10 cm），将上清移至EP 管中，-70 ℃保存待测。应用TRIzol 法提取血清中总RNA，溶于DEPC 水中，Narodrop 检测总 RNA 的浓度及纯度，OD260/OD280介于 1.8～2.0。以总RNA 为模板，反转录为cDNA。以cDNA 为模板，进行PCR 反应。总反应体系包括模板1µL cD⁃NA、0.2 µL Taq 聚合酶、1 µL 上游及下游引物、10µL 2×SYBR Green mix 和 1 µL 20 mmol/L dNTPs，ddH2O 补足 20 µL。反应条件：95 ℃预变性 60 s，95 ℃变性 15 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 10 s，变性退火延伸共40 个循环。miR-155 正向引物序列：5"-TTAATGCTAATCGTGATAGGGG-3"，反向引物序列：5"-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3"；内参基因 U6正向序列：5"-CTCGCTTCGGCAGCACA-3"，反向序列 ：3"-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-5"。 采 用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。应用速率散射比浊法检测外周血的C 反应蛋白（CRP），应用魏氏法检测红细胞沉降率（ESR）。

1.3 UC 内镜下严重程度评价及临床活动度评价 采用UC 内镜下严重度指数评分（UCEIS 评分）对受累肠段严重程度评分［8］，评分内容包括血管纹路（0～2 分）、出血情况（0～3 分）及糜烂溃疡（0～3分），评分越高，受累肠段病情越重。UC 缓解期UCEIS 评分 0～1 分，活动期 2～8 分。UC 临床活动度采用 Mayo 评分评价［9］，症状缓解为 0～2 分、轻度活动为3～5 分、中度活动为6～10 分、重度活动为11～12分。

1.4 随访 所有患者出院后以门诊或电话方式随访，每月随访1次，随访2年，随访内容为患者复发情况，复发标准参考《炎性肠病诊断与治疗的共识意见》中关于UC 的诊断内容。随访截止至2019 年12月。随访终点为患者复发或随访结束。

1.5 统计学方法 采用SPSS20.0 统计软件。计量资料以-x±s表示，两组间比较采用两独立样本t检验；多组间比较采用F检验，进一步两两比较采用q检验。计数资料比较采用χ2检验。采用Pearson 线性相关分析miR-155 与UCEIS 评分及Mayo 评分的相关性。采用多因素Logistic回归分析UC患者复发的危险因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清miR-155 表达比较 对照组与UC 组miR-155 相对表达量分别为 0.35 ± 0.07、1.95 ±0.36，两组比较P<0.01。

2.2 UC 不同临床活动度患者血清miR-155、Mayo评分及UCEIS 评分比较 UC 缓解期、UC 活动期患者 miR-155 相对表达量分别为 1.67 ± 0.36、2.12 ±0.41，两组比较P<0.01。UC 不同临床活动度患者血清miR-155、Mayo 评分及UCEIS 评分比较见表1。Pearson 线性相关分析结果显示，UC 活动期患者血清 miR-155 与 Mayo 评分及 UCEIS 评分呈正相关（r分别为0.512、0.603，P均<0.01）。见表1。

表1 UC不同临床活动度患者血清miR-155表达、Mayo评分及Baron评分比较（±s）

表1 UC不同临床活动度患者血清miR-155表达、Mayo评分及Baron评分比较（±s）

注：与轻度相比，＊P<0.05；与中度相比，#P<0.05。

临床活动度轻度中度重度F P n 19 22 20 miR-155相对表达量1.85±0.46 2.11±0.44＊2.39±0.38＊#7.671<0.01 Mayo评分（分）3.46±0.71 5.22±0.94＊8.76± 1.25＊#145.002<0.01 UCEIS评分（分）3.49±0.81 4.22±0.90＊5.96± 1.10＊#11.793<0.01

2.3 血清miR-155 与UC 复发的关系 随访过程中，UC 组 97 例患者中无复发 48 例、复发 49 例，复发率50.5%（49/97）。UC 患者复发与肠外表现、血清miR-155、ESR 及 CRP 有关（P均<0.05），而与性别、年龄、BMI、吸烟史及病变位置无关。见表2。

表2 影响UC患者复发的危险因素单因素分析

将肠外表现、CRP、ESR和miR-155作为自变量，将复发与否作为因变量，进行多因素Logistic 回归分析。结果发现，肠外表现、CRP、ESR 和 miR-155 是UC患者复发的危险因素。见表3。

3 讨论

UC 是病因及发病机制不明的胃肠道慢性炎性疾病，属于IBD的一种类型。近年来我国UC发病率有逐渐增加的趋势，严重威胁我国人民身体健康。目前UC 尚缺乏特异性的诊断指标，易将感染性结肠炎、克罗恩病等误诊为UC，并且UC 病程较长，复发率高，肠道长期慢性炎症有肿瘤发生的风险［10］。因此，深入研究UC 疾病发生发展的机制，寻找有效诊断评估UC 病情程度的血清学指标，探讨UC 复发的危险因素，对于评估IBD 患者病情及预后具有重要的临床意义。miRNA 是近年来发现的小的非编码RNA 分子，以往认为是转录过程中的“分子垃圾”，但大量研究发现其在炎症、免疫及肿瘤等多种病理过程中发挥重要的调控作用［11］。检测患者外周血中miRNA 水平变化有助于疾病的早期诊断、治疗及随访，是一种有潜在价值的血清标志物［12］。

表3 影响UC患者复发的危险因素多因素Logistic回归分析

miR-155 是一种多功能的microRNA，最初发现其具有免疫调节功能，在先天和适应性免疫应答中发挥重要作用［13］。研究表明，miR-155对IBD的发生发展也至关重要，在UC 肠黏膜组织中过表达，并能够通过激活Wnt信号通路，下调E-钙黏素的表达，促进上皮间质转化，导致UC 的发生［14］。本研究中，UC患者血清miR-155 表达高于对照组。目前其机制尚不清楚，可能与肠道局部炎症环境中免疫细胞分泌的细胞因子失调有关。研究表明，炎症微环境中的中性粒细胞、巨噬细胞等能产生大量促炎细胞因子，如 TNF-α，TNF-α 能够激活核因子κB 信号通路，转录因子结合于miR-155启动子区域，促进miR-155表达上调，进而引起UC 的发生［15］。此外本研究发现，UC 患者血清miR-155 表达与疾病的活动性有关，活动期患者血清miR-155 表达高于缓解期，并且miR-155与反映活动期病情程度的Mayo评分及UCEIS评分呈正相关。表明miR-155 参与UC 的发生发展，有可能成为判断UC 活动期病情严重程度的血清标志物。研究发现，miR-155 表达上调后能够抑制IL-6、IL-8 等抗炎细胞因子的产生，加重炎症微环境中促炎及抗炎平衡系统的失调，导致UC 疾病进展［16］。此外，miR-155 通过影响靶基因的表达，影响多种免疫细胞的功能，如miR-155能够结合并抑制Jarid2基因的表达，引起Th17 细胞中notch1 信号通路的过度活化，产生大量IL-17细胞因子，IL-17招募大量中性粒细胞进入局部组织，从而加重UC 肠壁组织损伤［17］。本研究对 UC 组 97 例患者随访 2 年，49 例患者复发。进一步采用单因素及多因素Logistic 回归分析影响UC复发的危险因素，发现肠外表现、CRP、ESR 和miR-155 是UC 患者复发的危险因素。血清高miR-155 表达患者UC 复发风险高于低表达者，与miR-155 参与UC 的发生发展的过程有关。可能是血清高miR-155 表达的UC 患者由于肠壁病变较重，肠黏膜愈合时间长，肠黏膜上皮屏障功能障碍，加上肠黏膜上皮细胞分泌的抗菌因子减少导致杀菌屏障功能不足，导致肠道细菌易突破肠道屏障，引起UC复发［18］。CRP 和 ESR 是 UC 诊断及治疗中常用的生物学指标，与UC 病情活动有关，本研究发现两者是UC 复发的危险因素。可能是机体炎症介质如IL-1、TNF-α 等水平升高促进肝脏合成CRP 合成，因而CRP水平越高的UC患者复发风险越高。此外，血清中某些蛋白成分改变及红细胞压积的变化常引起ESR 上升，ESR 较高反映机体仍处于炎症状态，增加UC 复发的风险。UC 病变以肠道为主，但同时可伴有关节炎、口腔溃疡等肠外表现，本研究中伴有肠外表现的患者UC 复发率较高。其原因可能是UC 肠外表现与肠道的炎症程度密切相关，肠道炎症程度越重，肠外表现的发生率越高，增加UC复发［19］。

综上所述，UC 患者血清miR-155 表达高，miR-155与IBD疾病活动性及活动期严重程度有关，血清高miR-155 表达是UC 疾病复发的危险因素。miR-155 有可能成为反映UC 患者病情及判断预后的血清标志物，具有一定的临床价值。