基于系统药理学探讨消癌解毒方防治结直肠腺瘤性息肉癌变机制*

陈婷婷，沈卫星，程海波

南京中医药大学/江苏省中医药防治肿瘤协同创新中心，江苏南京210023

结直肠癌已跃居全球癌症相关死亡原因的第三位［1］。其中结直肠腺瘤性息肉作为结直肠癌主要的癌前病变，已有确凿证据表明其是结肠癌发病的高危因素，流行病学资料显示腺瘤发病率越高则肠癌发病率也越高，且相关机制研究已形成“腺瘤-癌变”假说［2］。肠镜下切除术作为结直肠腺瘤性息肉的主要治疗手段，可降低但不能长期预防腺瘤性息肉的再发或癌变，当前多采取非甾体抗炎药、阿司匹林、适当补充钙剂和维生素D、生活饮食习惯调护等来预防结直肠腺瘤性息肉的复发、癌变。目前，尚未见公认的预防结直肠腺瘤性息肉复发、癌变的标准治疗方案［3］。

中医“治未病”理论体系随时代的不断发展，促使中医药防治结直肠恶性肿瘤逐渐成为临床研究重点。依托国医大师周仲瑛教授的“癌毒”病机理论、临床实践，笔者提出结直肠腺瘤性息肉的基本病机为“脾虚毒蕴”，并创立了防治结直肠腺瘤性息肉复发、癌变的中药复方“消癌解毒方”（白花蛇舌草、苦参、党参、白术、乌梅、黄连），大样本临床随机观察尚在研究中。前期研究发现该药能够降低结直肠腺瘤性息肉再复发及疾病恶化（异型增生、癌变）。

网络药理学是一门从系统层面研究中医药的新兴学科，运用生物网络数据库和相关分析技术构建“药物-靶点-疾病”之间复杂网络关系，可快速、系统地预测和分析药物作用潜在机制。本研究拟应用网络药理学相关技术，分析消癌解毒方中主要核心药物防治结直肠腺瘤性息肉癌变的作用靶标、信号通路，并进行相关潜在机制的分类富集分析，揭示消癌解毒方通过多靶点、多通路防治疾病不良病变的思路和依据［4-5］。

1 资料与方法

1.1 构建消癌解毒方对应化学成分数据集依托中药系统药理学数据库（traditional Chinesemedicine systems pharmacology，TCMSP；http://lsp.nwu.edu.cn/index.php），检索白花蛇舌草（Hedyotis Diffusae Herba）、苦参（Sophorae Flavescentis Radix）、党参（Codonopsis Radix）、白术（Atractylodes Macrocephala Koidz）、乌梅（Mume Fructus）、黄连（Coptidis Rhizoma）对应的化学成分，设定药物口服生物利用度（oral Bioavailability，OB）值≥30%且药物相似性（drug Similarity，DL）≥0.15为筛选条件，建立对应中药的化学成分数据集。

1.2 构建消癌解毒方化学成分对应靶点数据集

借助TCMSP数据库检索筛选得到的各化学成分对应靶点，构建化合物对应靶点数据库。用于研究口服消癌解毒方防治结直肠腺瘤性息肉癌变的潜在机制。

1.3 构建结直肠腺瘤性息肉和结直肠癌疾病对应靶点库分别以“Colorectal Adenoma”“Colorectal cancer”为关键词，查阅人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM:https://omim.org/）、治疗靶点数据库（Therapeutic Target Database，TTD:http://db.idrblab.net/ttd/）、药物基因组学 知 识 库 （Pharmacogenomics Knowledgebase，PharmGkb:https://www.pharmgkb.org/）及疾病基因搜索系统（Disease Gene Search Engine with Evidence Sentences，DiGSeE:http://210.107.182.61/geneSearch/）收集对应靶点，构建对应的疾病-靶点数据库。

1.4 构建“消癌解毒方-化合物-关键靶点”子网络通过蛋白数据库（Uniprot:http://www.uniprot.org/）对化合物对应靶点和疾病对应靶点进行校正和统一。运用生物信息学与进化基因组学平台（Bioinformatics＆ Evolutionary Genomics:http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）将校准后的靶点取交集提取关键靶点。同时通过Cytoscape（3.2.1）（http://cytoscapeweb.cytoscape.org/）构建中药-化合物-靶点网络和疾病-靶点网络，将两网络进行整合，结合Bioinformatics＆Evolutionary Genomics平台得到的关键靶点，最终提取整合后的网络中关键靶点所对应的网络图，形成中药-化合物-关键靶点网络并进行分析。

1.5 对关键靶点进行GO和KEGG富集分析基因本体（gene ontology，GO）是一个基因功能分类的标准化系统，常见的3个主要分类包括生物学过程（biological process）、细胞成分（cellular components）和分子功能（molecular function）［6］，运用Enrichr数据库（http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/）对关键潜在靶点进行GO功能富集分析，同时下载京都基因和基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信号通路相关数据，在omicshare软件平台（https://www.omicshare.com）进行富集，从系统生物学角度对消癌解毒方防治结直肠腺瘤性息肉癌变潜在机制进行预测。

2 结果

2.1 消癌解毒方对应化合物TCMSP数据库检索到符合筛选条件的中药白花蛇舌草对应的化合物7个、苦参对应的化合物43个、党参对应的化合物19个、白术对应的化合物7个、乌梅对应的化合物8个、黄连对应的化合物10个，为进一步检索各化合物对应靶点做准备。

2.2 消癌解毒方化学成分对应靶点在TCMSP数据库对符合筛选条件的各化学成分对应靶点进行检索，其中白花蛇舌草对应的7个化合物中有5个化合物有对应的靶点236个，苦参对应的43个化合物可检索到对应靶点509个，党参对应的16个化合物可检索到对应靶点211个，白术对应的4个化合物可检索到对应靶点23个，乌梅对应的8个化合物可检索到对应靶点302个，黄连对应的9个化学成分可检索到对应靶点264个。将上述各化合物对应靶点合并，共得到1 545个对应化合物靶点，其中唯一靶点243个，为进一步构建化合物-靶点网络，研究口服消癌解毒方防治结直肠腺瘤性息肉癌变的潜在机制做准备。

2.3 结直肠腺瘤性息肉与结直肠癌疾病对应靶点

以对应的疾病名在OMIM、TTD、PharmGkb及DiGSeE数据库进行检索、收集对应靶点，并通过Uniprot数据库选择“Homo sapiens”对两种疾病及消癌解毒方所含化合物对应靶点进行校正和统一，共得到“Colorectal Adenoma”对应唯一靶点3 279个、“Colorectal cancer”对应唯一靶点4 119个、消癌解毒方所含化合物对应唯一靶点235个，将三者的靶点通过Bioinformatics＆Evolutionary Genomics平台取交集（见图1），结直肠癌、结直肠腺瘤性息肉与消癌解毒方共有相同靶点110个，将其设定为消癌解毒方治疗结直肠腺瘤性息肉癌变的关键潜在靶点，为构建中药-化学成分-关键靶点网络做准备。

2.4 “消癌解毒方-化合物-关键靶点”网络的构建运用Cytoscape软件分别构建中药-化合物-关键靶点网络和疾病-靶点网络，并进行整合得到中药-化合物-疾病-靶点网络，结合2.3项下110个关键潜在靶点信息，提取关键靶点相关子网络，形成“消癌解毒方-化合物-关键靶点”网络（图2，其中三角形代表消癌解毒方、六边形代表各味中药，圆形代表靶点和化合物，节点颜色越深代表节点度赋值越高）。图2网络中，共包含213个节点、556条边，以节点度值Degree≥20为界，得到消癌解毒方包含的中药苦参、党参对应的节点度值分别为44、20，为该网络中的关键中药；槲皮素（quercetin）、木樨草素（luteolin）、山柰酚（kaempferol）、7-甲氧基-2-甲基异黄酮（7-Methoxy-2-methyl isoflavone）节点度值分别为86、43、38、20，为该网络中较为重要的有效成分；相关靶点中环加氧酶2（prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2）、环加氧酶1（prostaglandin endoperoxide synthase 1，PTGS1）、核受体辅激活蛋白2（nuclear receptor coactivator 2，NCOA2）、雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1）节点度值分别为39、30、24、20，为该网络中的关键作用靶点。

图1 肠癌、肠腺瘤、消癌解毒方对应靶点韦恩图

图2 关键潜在靶点的中药-化合物-关键靶点网络图

2.5 关键靶点的GO富集结果结合Enrichr数据库功能，对110个关键潜在靶点进行GO功能富集（见图3），富集后得到参与生物过程的关键靶点分别为:白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、细胞核因子κp65蛋白（nuclear factor-KBp65，RelA）、苏氨酸蛋白激酶1（protein-threonine kinases AKT1）、血管内皮生长因子A（vascular endothlial growth factor，VEGFA）、沉默信息调节因子1（Sirtuin1，SIRT1）、抑癌基因P53（Tumor Protein P53，TP53）等，作用的生物学过程主要集中在细胞对刺激因子的反应、凋亡过程的调控、细胞因子介导的信号通路、程序性细胞死亡的负调控、基因表达的正调控、核酸转录的正调控、细胞对活性氧的反应、转录正调控、细胞增殖调控、细胞内信号转导的调控、MAPK级联激活（Mitogen-activated protein kinase cascade，MAPK cascade）的正向调节、细胞对氧化应激的反应、RNA聚合酶II启动子转录调控、蛋白质磷酸化的正调控等。富集得到的参与细胞成分的关键靶点分别为:TP53、沉默信息调节因子1（Silent information regulator，SIRT1）、核转录因子激活蛋白1（Activator protein-1，AP-1）、重组人有丝分裂原激活蛋白激酶1（Recombinant Human Mitogen-Activated Protein Kinase 1，MAPK1）、过氧化物酶体增殖物激活受体（Peroxisome proliferators-activated receptors，PPARD）、转录因子1（E2F Transcription Factor 1，E2F1）、重组人谷胱甘肽S-转移酶Pi1（Recombinant Human Glutathione S-Transferase pi 1，GSTP1）等，作用的细胞成分主要集中在细胞分泌颗粒管腔、细胞质膜穴样内陷、细胞核染色体部分、脂膜筏、血小板α颗粒管腔、线粒体外膜、细胞质囊腔等。富集得到参与分子功能的关键靶点有:TP53、RelA、ESR1、AP-1、EGFR、重组人受体酪氨酸激酶（recombinant human tyrosine kinase receptor ErbB-3，ErbB-3）、糖皮质激素受体（nuclear receptor subfamily 3 group Cmember 1，NR3C1）等，作用的分子功能主要包括蛋白激酶结合因子、泛素样蛋白连接酶结合因子、转录调控区DNA结合因子、核心启动子结合因子、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶活性因子、RNA聚合酶II转录因子结合因子、核心启动子近端序列特异性DNA结合因子等。

图3 关键潜在靶点的GO富集分析图

2.6 关键靶点的KEGG富集结果从Enrichr数据库下载KEGG通路相关数据，转换为omicshare平台相匹配的格式后进行分析，共得到KEGG富集通路108条，其中P＜0.01的有88条，基因富集数量最高为42个、最低为2个。采用P值和基因富集数量交叉筛选的方法，筛选出富集排名前20位的信号通路［7］（见图4）。可见消癌解毒方防治结直肠腺瘤性息肉癌变的关键潜在靶点富集得到的主要信号通路包括癌症途径、前列腺癌、AGE-RAGE信号通路、乙型病毒性肝炎、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、人巨细胞病毒感染、胰腺癌、EB病毒感染、麻疹、人T细胞白血病病毒1型感染、癌症中的蛋白多糖、丙型病毒性肝炎、膀胱癌、细胞衰老、细胞凋亡、小细胞肺癌途径等。

图4 关键潜在靶点的KEGG富集分析图

3 讨论

防治结直肠腺瘤性息肉癌变和复发的消癌解毒方，主要由党参、苦参、白术、黄连、乌梅、白花蛇舌草等组成。其中党参、白术主补气虚、血虚，调和健脾［8-10］；白花蛇舌草、苦参、黄连专于解毒，尤以热毒、湿毒为主，并可防治癌毒；乌梅不仅可下虚火、固肠脱，其性多有收涩、泻下、重镇的特点，是为沉降之药，而且可作为引经药，引药入肠腑［11］。除核心药物外，另有助祛肠腑寒湿药辅助，这些药物之间的制化协助关系，保持人身整体的协调平衡和机体内环境的统一。

疾病与机体之间的相互关联作用机制错综复杂，致病因素反馈过程的机理也纵横交错，治疗的药物只有通过多途径、多系统协调，才能发挥相对有效的防治疾病作用。本研究通过网络分析，预测消癌解毒方可对结直肠腺瘤性息肉、结直肠癌的多个靶点、多个通路发挥作用，其中槲皮素、木樨草素、山柰酚等成分已经过论证具有防治结直肠癌变的作用［12］。既往研究显示，姜黄素和槲皮素联合防治肠腺瘤复发和癌变可能具有一定疗效，作用机制主要为阻滞细胞周期、抑制细胞侵袭及转移、调节肿瘤信号转导通路、抑制相关基因与蛋白的表达等［13］。木樨草素通过抑制Wnt/β-catenin/TCF-4信号通路来抑制结直肠癌［14］。山柰酚则通过上调p53的蛋白表达量抑制结肠癌细胞增殖［15］。上述已有的研究结果与预测结果基本一致，提示消癌解毒方主要有效成分对结直肠腺瘤性息肉癌变具有一定的防治作用。

结合上述GO富集分析结果，消癌解毒方防治结直肠腺瘤性息肉癌变的潜在靶基因富集结果显示，其作用的主要关键靶点有TP53、SIRT1、JUN、RELA、EGFR、IKBKB、IRF1等。TP53突变是恶性肿瘤发展的潜在预测因子，是促使腺瘤向腺癌转变的关键步骤［16-17］。SIRT1是腺瘤癌变过程中的重要物质［18］。SIRT1与P53可能起协同作用促进结肠癌的发生［19］。JUN参与结直肠癌疾病进程，可能成为结直肠癌预防和治疗的潜在靶点［20］。RELA通路促进肠上皮细胞趋向疾病［21］。EGFR、P53基因均参与结直肠腺瘤性息肉癌变，EGFR可能作用于早期，P53基因则可能作用于晚期［22］。因此检测EGFR、P53对早期诊断结直肠腺瘤性息肉癌变有一定的临床意义。IKBKB参与多种免疫细胞对激活刺激的反应［23］，可能通过免疫受损促进肠上皮细胞癌变。IRF1通过抑制RAS-RAC1通路抑制大肠癌细胞的增殖和转移［24］，其在结直肠癌组织中表达下调，功能上发挥抑癌作用［25］。通过分析可知，SIRT1、P53、JUN、RELA、IKBKB可促进肠癌的发生，为消癌解毒方预防和治疗结直肠腺瘤性息肉癌变的潜在作用靶点；EGFR、P53基因则可作为消癌解毒方逆转腺瘤癌变的关键靶点；IRF1则可作为消癌解毒方抑制结直肠癌变的潜在靶点进行深入研究。

KEGG通路富集结果主要集中在PI3K-Akt、IL-17、肿瘤坏死因子等通路上，涉及免疫炎症反应、代谢、细胞分化和凋亡等多个复杂的生物学系统。PI3K-AKT这一自噬经典信号通路与结肠癌转移关系密切［26］。IL-17在结直肠癌组织中表达水平最高、癌旁组织次之、正常黏膜组织最低［27］。该信号通路可能为结肠癌发生发展过程中的重要促进因子。肿瘤坏死因子、表皮生长因子受体在结直肠腺瘤性息肉组织中表达均高于正常大肠黏膜组织，两者相关的通路可能在结直肠腺瘤性息肉的发生和发展过程中发挥重要作用［28］。晚期结肠癌肿瘤组织TNF-α、IL-6阳性表达率均高于早期，证明TNF-α和IL-6在结直肠癌发生、发展中起免疫调节作用［29］。由此可见，与免疫炎症反应、细胞衰老和凋亡等疾病相关的通路也有可能成为消癌解毒方防治结直肠腺瘤性息肉癌变的靶点。

本研究基于系统思维的方法，运用网络药理学相关技术，对消癌解毒方防治结直肠腺瘤性息肉癌变的潜在作用机制进行预测。结果发现，消癌解毒方中的槲皮素、木樨草素、山柰酚等有效化合物可能通过PI3K/Akt信号通路、IL-17信号通路、癌症中的蛋白多糖、细胞衰老、细胞凋亡等信号通路，作用于PTGS2、PTGS1、IL6、EGFR、AKT1、TP53、JUN等关键靶蛋白而发挥防治结直肠腺瘤性息肉癌变的功效。从系统生物学角度对消癌解毒方防治结直肠腺瘤性息肉癌变潜在机制进行预测结果的分析，符合中医运用复方中药多组分、多系统、多靶点、多途径整体调理机体、防治疾病的特点。但运用多个数据库筛选核心化合物和靶标、多个软件平台处理数据、多组文献研究进行印证分析结果，均不够客观，可能在以上研究中混杂较多影响因素，导致输出或分析结果存在一定的局限性，故需要今后努力在基础和临床研究中将预测结果进行深入验证。