基于TGF-β/smad信号通路探讨七方胃痛颗粒对人胃腺癌AGS细胞上皮间质转化的影响*

袁铁超，陈国忠，彭振西，易志忠，欧智海

1.广西中医药大学，广西南宁530001；2.广西中医药大学第一附属医院，广西南宁530023

胃癌是全世界最常见的消化系统恶性肿瘤之一，由于其发病机制复杂，缺乏有效的治疗措施，导致患者治疗效果不佳，死亡率高［1］。肿瘤细胞的转移历经上皮间质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）、定向侵袭、侵入血液循环等过程［2］。其中EMT是指上皮细胞转化为间质型细胞的生物过程。该过程中原属上皮型细胞经过形态和骨架结构的改变而逐渐舍去细胞极性及胞间连接，获得间质型细胞的特性，且获得侵袭和迁移能力［3］。而肿瘤患者致死率高的主要原因则是癌细胞的迁移、侵袭及转移［4］，因此，阻止或抑制EMT的产生，可以克制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，对患者的预后及治疗有着积极作用。七方胃痛颗粒的功效以益气健脾为主，消积导滞、清肝降逆、活血化瘀为辅。前期研究发现，七方胃痛颗粒可以抑制人胃癌细胞增殖并促其凋亡［5-7］，但其能否影响人胃腺癌AGS细胞上皮间质转化有待进一步证实。因此，本研究就七方胃痛颗粒对人胃腺癌AGS-EMT细胞进行干预，观察干预后对胃癌细胞ZEB2、E-cad及Vimentin的影响，以阐明其对人胃腺癌AGS细胞上皮间质转化的干预作用及机制，为七方胃痛颗粒在临床上推广使用提供有力的依据。

1 材料

1.1 人胃腺癌AGS细胞与动物人胃腺癌AGS细胞系购于上海慧颖生物科技有限公司，贴壁生长，置于37℃和5%CO2条件的培养箱中培养。雄性SPF级健康Wistar大鼠40只，体质量100～150 g，购于湖南省长沙市天勤生物技术有限公司，实验动物使用许可证:SCXK（湘）2014-0011。在广西中医药大学实验中心（SYXK桂2019-0001）饲养。实验涉及动物的饲养和实验过程严格遵守广西中医药大学实验动物管理与保护的有关准则，并且严格按照实验动物使用的3 R原则给予人道主义的关怀照顾，且通过广西中医药大学医学伦理委员会审查，伦理审批号:DW20190920-34。

1.2 药品和试剂七方胃痛颗粒为江阴天江药业有限公司生产的免煎中药颗粒，由广西中医药大学第一附属医院制剂室提供，其组成为生黄芪30 g，白术10 g，茯苓10 g，炙甘草9 g，红参10 g，白芍30 g，炒鸡内金9 g，枳实10 g，木香6 g，黄连6 g，吴茱萸3 g，丹参6 g，中药颗粒被混合搅匀并按每袋8 g的规格灭菌包装。胎牛血清（上海依科赛生物制品有限公司，货号:FCS500）；柠檬酸盐缓冲液（10 mM pH 3.0）（深圳欣博盛生物科技有限公司，货号:NP-1510-03）；TGF-β1［美国PeproTech（派普泰克）公司中国代表处，货号:100-21］；TGF-β/Smad抑制剂LY2109761［Selleck（中国）公司，货号:S2704］；冻存液（北京索莱宝科技有限公司，货号:D8371）；胰蛋白酶-EDTA消化液（北京索莱宝科技有限公司，货号:T1300）；青链霉素混合液（100X）（北京索莱宝科技有限公司，货号:P1400）；DMEM高糖培养基［赛默飞世尔（苏州）仪器有限公司，货号:11965092］；PBS缓冲液（凯基生物，货号:KGB5001）；Trizon Reagent（CWBIO康为世纪，货号:CW0580S）；Ultrapure RNA超纯RNA提取试剂盒（CWBIO 康为世纪，货号:CW0581M）；HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒（CWBIO康为世纪，货号:CW2569M）；UltraSYBR Mixture（CWBIO康为世纪，货号:CW0957M）；RIPA裂解液（北京普利莱基因技术有限公司，货号:C1053）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（康为世纪，货号:CW0014S）；Marker（Thermo，货号:26617）；PVDF膜（Millipore，货号:IPVH00010）；封闭专用脱脂奶粉（北京普利莱基因技术有限公司，货号:P1622）。引物（苏州金唯智生物科技有限公司）。

1.3 仪器荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；5810R台式冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；371高温灭菌CO2培养箱（美国Thermo公司）。

2 方法

2.1 人胃腺癌AGS细胞EMT模型建立细胞生长密度高达80%时，须分植至新的培养皿或瓶中，一般稀释比例为1∶3。当细胞传代达一定数量后，用10μg·L-1的TGF-β1处理AGS细胞，连续培养3代，建立EMT模型［8］。

2.2 实验分组将细胞分为3组，空白组（无处理的EMT模型）、七方胃痛颗粒（含药血清+EMT模型）组、LY2109761（TGF-β1/Smad抑制剂+EMT模型）组。

2.3 药物制备TGF-β/Smad抑制剂LY2109761，体外实验给药时浓度稀释为10μmol·L-1。TGFβ1，体外实验给药时浓度稀释为10μg·L-1。实验前称取七方胃痛颗粒所需的药物。

2.4 药物血清制备将大鼠随机分为药物组、空白组，每组20只。分别给予七方胃痛颗粒（给药剂量＝临床常用剂量×动物等剂量系数×培养液内稀释浓度［9］）和生理盐水灌胃。先将药物用生理盐水稀释，配置成2 g·mL-1的药物混悬溶液给大鼠灌胃，方案按照1 mL·100 g-1给药，每日给药2次，连续7天。于末次给药后1 h腹主动脉采血，血样置于10 mL离心管，静置2 h以上，离心半径8 cm，3 000 r·min-1离心15 min，无菌分离血清。将血清置于56℃水浴30 min灭活，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，置于-20℃下保存备用。空白组大鼠除给予生理盐水代替七方胃痛颗粒灌胃之外，余同七方胃痛颗粒含药血清制备方法。实验前将EMT模型AGS细胞传代培养，将其接种于含DMEM培养基的96孔板中培养，约12 h后，待细胞贴壁，换上冻存融化的含药血清作用细胞24 h、48 h、72 h后观察其生长情况。

2.5 RT-PCR法检测ZEB2、E-cad及vimentin的表达提取细胞的总RNA，遵守操作说明对其进行反转录，合成cDNA，以GAPDH为内参［10］，采取实时荧光定量PCR法检测目的基因mRNA的表达，再进行定量PCR扩增，其反应条件为:95℃预变性5 min进入循环，95℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃1 min，共33个循环后，最终测定不同样本的Ct值，以公式2-△△Ct计算反映各样品目的基因相对表达量的差异。见表1。

表1 引物信息

2.6 W estern blot法检测ZEB2、E-cad及Vimentin的表达提取细胞总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液按1∶4比例加入蛋白中煮沸5 min，取50μg蛋白在12%的SDS-PAGE凝胶中电泳，100 mA恒流电转70 min，将蛋白转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶非特异性封闭1 h，加入一抗抗体4℃过夜，加入二抗室温孵育1 h，ECL显影5～10 min。图像结果用Quanty-one分析软件进行分析，以目的蛋白/内参的灰度比值表示相对目的蛋白水平。

2.7 统计学方法采用SPSS 20.0软件进行统计分析。数据资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 七方胃痛颗粒对EMT模型中ZEB2 m RNA、Vimentin m RNA表达的影响与空白组比较，七方胃痛颗粒组和LY2109761组作用24 h、48 h、72 h后均能明显下调ZEB2 mRNA、Vimentin mRNA表达（P＜0.05）；与七方胃痛颗粒组相比，LY2109761组ZEB2 mRNA的表达明显下调（P＜0.05），而Vimentin mRNA下调在相同时间下相近（P＞0.05）。该结果提示七方胃痛颗粒中药血清具有抑制EMT模型AGS-EMT细胞ZEB2 mRNA、Vimentin mRNA的表达，且其抑制ZEB2作用不如TGF-β1的抑制剂LY2109761。见图1、图2。

3.2 七方胃痛颗粒对EMT模型中E-cadmRNA表达的影响与空白组比较，七方胃痛颗粒组和LY2109761组作用24 h、48 h、72 h后均能明显上调E-cad mRNA表达（P＜0.05）；随着干预时间延长，其表达有差异，在48 h、72 h时间段均出现促进。与七方胃痛颗粒组相比，LY2109761组在24 h、48 h、72 h均能明显上调E-cad mRNA表达（P＜0.05）。该结果提示七方胃痛颗粒中药血清具有促进AGSEMT细胞E-cad mRNA的表达，但其促进作用不如TGF-β1抑制剂LY2109761。见图3。

图1 七方胃痛颗粒对EMT模型中ZEB2 mRNA表达的影响

图2 七方胃痛颗粒对EM T模型中Vimentin m RNA表达的影响

图3 七方胃痛颗粒对EMT模型中E-cad m RNA表达的影响

3.3 七方胃痛颗粒对EMT模型中ZEB2、vimentin、E-cad的蛋白表达的影响与空白组相比，七方胃痛颗粒和LY2109761组分别干预AGS-EMT细胞24 h、48 h、72 h后，ZEB2、Vimentin的蛋白表达水平明显降低（P＜0.05），E-cad的蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）；与七方胃痛颗粒组相比，LY2109761组在24 h、48 h、72 h均能明显下调ZEB2表达（P＜0.05）。提示七方胃痛颗粒与LY2109761作用相近，且随之干预时间增加对于Ecad作用更明显，进一步确认了七方胃痛颗粒在调控EMT方面的作用。见图4。

图4 七方胃痛颗粒对EMT模型中ZEB2、vimentin、E-cad的蛋白表达的影响

4 讨论

胃癌在我国引起的死亡约占全球的一半，对人民的身体健康造成极大危害［11］。其发病机制尚不明确，研究表明其发生涉及多信号、多基因的复杂过程［12］。胃癌细胞的侵袭转移是影响胃癌疗效的主要原因［13］，而在肿瘤细胞的迁移及侵袭过程中，EMT这一过程则起着不容忽视的关键作用。研究发现，EMT的形成与TGF-β/smad信号通路的ZEB2、E-cad、Vimentin等因子关系密切，它们与胃癌的侵袭深度、淋巴转移及分期密切相关。TGFβ1作为TGF-β主要存在形式在肿瘤发生发展中起重要作用［14］。TGF-β可抑制E-cad的表达并促发EMT［15］，也可促进肿瘤EMT发生，增强肿瘤细胞的侵袭和迁移能力，促进肿瘤转移［16］。研究证实TGF-β1可诱导人胃癌细胞发生EMT，并增强其侵袭和迁移能力［17］。而TGF-β/smad为TGF-β促进肿瘤EMT发生的重要信号通路，TGF-β/smad信号通路可诱导snail、slug、ZEB1、ZEB2、Twist等与EMT密切相关的转录因子表达，从而抑制E-cad表达，促进EMT发生［18］。E-cad是EMT过程中的重要分子，E-cad在EMT过程中表达降低，使细胞间黏附破坏，增加细胞能动性和推进癌症向晚期进展。在肿瘤中，E-cad的低表达可以活化诱导致癌因子，激活TGF-β、EGF、NF-κB、Wnt、HIF-1α等传导途径，从而促进EMT的形成［19］。ZEB2作为Snail超家族的重要成员可直接或间接下调E-cad表达并诱导EMT，ZEB2直接结合并抑制近端CDH1启动子处的E-cad并重塑细胞间粘附［20］。有报告显示，ZEB2除了能抑制其他上皮标志物，激活间充质基因［21］，还能重组上皮极性分子，阻碍基底膜形成以促进侵入性［22-24］。有研究显示ZEB与临床预后有关，靶向调节胃癌组织中ZEB2的表达可以增强SGC7901/DDP细胞对顺铂的敏感性，提示ZEB2高表达与人类癌症的较差预后密切相关［25］。Vimentin在胃癌中的表达已被作为胃癌预后价值评定标准多年，其表达量的上调，可使细胞失去细胞极性，细胞间连接被破坏，细胞粘附能力下降，运动能力增加，从而使细胞的迁移和侵袭能力增强［26］。最新的涉及1 598例样本的荟萃分析显示，Vimentin阳性表达与胃癌患者较差的整体存活率显著相关，且亚组分析显示Vimentin对中国患者的整体存活率有不利影响。

LY2109761是一种临床前研究阶段的新型ALK5/TGFβRII双靶点抑制剂［27］，虽然其在细胞研究阶段能显著抑制TGF-β1诱导的L3.6pl/GLT细胞迁移、侵袭和细胞中Smad2蛋白磷酸化水平。但在体外研究中，LY2109761目前只有在与其他药物联用或者联合放、化疗时才能减小肿瘤体积、降低肿瘤转移、抑制肿瘤微血管形成，增强放、化疗效果，且不良反应明显。

七方胃痛颗粒是广西中医药大学罗伟生教授在中医经典中溯本追源以探寻胃癌之病机后，结合长期的临床实践，取四君子汤、丹参饮、左金丸、逍遥散、枳实芍药散、枳术丸、木香槟榔丸等7个不同功效的经典方剂加减而成，其健脾益气针对胃癌之根本病机，扶助脾胃，助其抗邪。用活血化瘀之法消散积瘤瘀滞，促其气血运行；清热解毒之法可清散郁热，攻伐毒邪；理气化痰和中之法则可助脾胃之升降、运化，促进机体恢复之功效。

近年来，在防治胃癌及癌前病变的研究上，传统中医中药发挥其特色，已经在临床研究上取得一定的成果以及较好的疗效。中医对于肿瘤的认识在古籍里早有描述，大多可归为“癥瘕”“积聚”之类，同属于“邪气”这一范畴。《黄帝内经》云:“正气存内，邪不可干……邪之所凑，其气必虚。”《医宗必读·积聚》曰:“积之成者，正气不足，而后邪气踞之。”这提示肿瘤的形成与人体的正气密切相关，人体正气不足，无力御邪，使得邪气独居，以致“寒”“湿”“痰”“瘀”等病理产物形成，阻碍气血运行，以致气滞血瘀、痰湿搏结、寒凝血瘀，聚而成积，其积瘤之形成，阻碍气机，郁而化热。“壮火散气”，郁热进一步损耗元气，耗伤津血，气血津液不能濡养脾胃，从而使脾胃虚损，运化失司。胃为“水谷之海”，气血生化之源，胃气受损，后天之本无以生化正气，正气亏虚不能抑制肿瘤生长及转移，从而形成恶性循环。因此，中医治疗肿瘤，首当扶助正气，恢复人体抗邪的自卫能力。人之正气充足，则五脏功能协调，气机调畅不相失宜，“寒湿痰瘀”等病理产物自然祛除，积瘤自消矣。唯有正气充足，方能抗邪，故而“正虚邪积”为肿瘤之病机，而胃癌的病因主要为“脾胃虚弱”，后天之本生化失司，故“健脾益气”之法即为胃癌之治则。

本课题组前期动物实验研究显示，七方胃痛颗粒可阻断慢性萎缩性胃炎癌前病变的进一步发展，对防治慢性萎缩性胃炎癌前病变有明显效果［28-29］，并且可以抑制人胃腺癌细胞增殖并促进其凋亡。本研究显示含七方胃痛颗粒中药血清可以抑制AGS细胞上皮-间质转化，上调E-cad表达，下调ZEB2及Vimentin表达，且随着作用时间的延长，中药血清作用于AGS-EMT细胞的效果与TGF-β/Smad抑制剂作用相似。提示七方胃痛颗粒与TGF-β/smad信号通路抑制剂作用一致，能抑制TGF-β/smad信号通路，下调ZEB2、Vimentin，上调E-cad，增加细胞黏附，减少细胞破坏，减少细胞迁移和侵袭，且作用效果与时间呈正相关性。综上所述，七方胃痛颗粒对人胃腺癌AGS细胞具有抑制作用，其机制可能为抑制TGF-β/smad信号通路，从而抑制胃黏膜上皮的EMT。这体现了七方胃痛颗粒在防治胃癌方面的重大协同作用。