应用DNA提取改良和二次聚合酶链反应技术检测乌头及其炮制品

朱高倩， 李双良， 马莉， 周培军， 蒲星宇， 王丽， 符德欢

（1.云南省药物研究所，云南昆明 650111；2.云南白药集团创新研发中心，云南昆明 650111；3.云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室，云南昆明 650111）

乌头类药物有较为悠久的传统用药历史，具有祛风除湿、温经止痛等功效，广泛应用于风湿麻痹、关节疼痛等临床治疗中，在各类成药制剂、药材标准中占比较大[1]。该类药材均来自毛茛科（Ranunculaceae）乌头属（Aconitum）植物根茎。乌头属种类繁多，分布广泛，全球约有350种，我国约有167 种[2]，仅云南省境内就有约66 种，25 变种，4 变型[3]。《中华人民共和国药典》2000 年版、2005 年版、2010 年版、2015 年版等标准均有记载乌头类药材[4-7]。《中华本草》记载了60多种乌头属植物可入药[8]。目前，《云南省中药材标准》收载的乌头类药材仅有黄草乌一种[9]，但当地民间还将乌头属其他种也当作乌头类药材使用。目前，有些非国标或非省标的乌头属植物被盲目栽培，市场上充当国标或省标药材销售，难以通过产地判断乌头属药材的基原，市场上充斥了大量以国标或省标正品名销售的混伪品，加之乌头属种间的化学成分种类、含量可能会存在差异[10-12]，炮制前混杂的品种经过统一的炮制方法炮制后，导致有效成分（或有毒成分）含量可能不在预期范围内，进而导致入药后无效、低效或中毒。

目前，对于乌头属药材的鉴别，单纯通过性状、显微、理化等方法已不能满足市场药材种源鉴定的需求，研究发现，ITS、psbA-trnH 对乌头属植物具有一定的鉴别能力[13-14]。2015 年版《中华人民共和国药典》首次收载了“中药材DNA 条形码分子鉴定法指导原则”，植物类中药材选用ITS2/ITS 为主体序列，以叶绿体psbA-trnH 为辅助序列[7]。而DNA 条形码技术的应用成功与否取决于DNA 的成功提取和PCR 的成功扩增。乌头作为重要药材，其入药的关键即经过炮制，需“用水浸泡至内无干心，加水煮至取大个切开内无白心”[7]，长时间的水煮会使DNA严重降解[15-16]，加之乌头药用部位富含淀粉、多糖等成分也会干扰DNA 提取[17]，使得乌头属炮制品PCR 扩增难以有效实现，从而影响DNA 条形码技术在乌头药材鉴定的应用。因此，在DNA 提取方面，本研究从细胞裂解阶段和DNA 沉淀阶段入手，基于十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法[18]和十二烷基硫酸钠（SDS）法[19]，并参考前人研究所获得的DNA 提取改良方式[17，20]，对乌头属药用部位炮制前后DNA 提取方法进行系统分析，从裂解液类型、水浴时间、沉淀方式等方面进行改良比较。在PCR 扩增方面，将应用于临床上提高基因扩增效率的二次PCR 扩增技术[21-22]在炮制品DNA的PCR扩增中进行尝试，旨在探索对乌头属植物炮制前后样品DNA 提取和PCR 扩增适用性较好的方法，以期为产地、市场乌头类药材生品、炮制品的基原检测提供有效的技术支持，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1药材研究材料包括9 种乌头根茎生品和对应的炮制品，其中炮制品参照2015 年版《中华人民共和国药典》“制川乌”【制法】进行炮制，凭证标本由中国科学院华南植物园杨亲二研究员鉴定，标本保存于云南省药物研究所标本馆中。具体采集信息见表1。

1.2试剂CTAB 缓冲液（含1.4 mol/L NaCl）:100 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）、1.4 mol/L NaCl、20 mmol/L EDTA（pH8.0）、2%CTAB；CTAB缓冲液（含2.5 mol/L NaCl）:100 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）、2.5 mol/L NaCl、20 mmol/L EDTA（pH8.0）、2%CTAB；1%SDS:100 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）、10 mmol/L EDTA（pH8.0）、0.1 mol/L NaCl、1%SDS；植物基因组DNA 快速抽提试剂盒（上海生工公司，产品编号:B518231）；异丙醇、2 mol/L 醋酸 铵（NH4Ac）、无 水 乙 醇、1×TAE 缓 冲 液、BIOWEST G-10琼脂糖、花青素核酸染料均购自上海生工公司；2×Es TaqMasterMix（Dye）购自康为世纪公司。

表1 9种乌头属植物采集信息表Table 1 Collection information of 9 kinds of Aconitum plants

1.3仪器EYELA NTT-2000 水浴锅；Eppendorf Mastercycler PCR 扩增仪；北京六一DYY-6C 型电泳仪；Eppendorf Centrifuge 5418 离心机；ZF-258全自动凝胶成像分析系统。

1.4实验方法

1.4.1 实验设计 采用基于CTAB 法[18]和SDS 法[19]的12 种改良方法对9 种乌头生品和炮制品进行DNA提取，方案设计见表2。

1.4.2 DNA 提取 ①将9 种乌头根茎生品或炮制品研磨成细粉，取20 mg 左右样品进行提取。②加入表2 中1 ～12 的提取缓冲液1 mL，添加（+）或不添加（-）聚乙烯吡咯烷酮（PVP40）至终浓度1%，65 ℃水浴1 h 或3 h。③以12 000 × g 离心5 min，取上清液，加入等体积氯仿∶异戊醇（24∶1）重复4 次，以8 000×g 离心10 min。④取上清液，加入等体积异丙醇或5倍体积无水乙醇+1倍体积2 mol/L NH4Ac，颠倒混匀。⑤于4 ℃或-20 ℃过夜沉降反应。⑥以13 000×g 离心15 min。⑦沉淀干燥后加入100 μL ddH2O溶解备用。

表2 乌头生品和炮制品DNA提取的12种方法方案设计Table 2 Designs for 12 kinds of methods for extracting DNA from crude and preparing products of Aconitum

1.4.3 PCR 扩 增 提 取 的DNA 用ITS2F/ITS2R 进行PCR 扩增检测。正向引物ITS2F: 5’-ATGCGA TACTTGGTGTGAAT-3’；反向引物ITS2R:5’-G ACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’。引物由上海生工合成。PCR 反应体系为20 μL，包括ITS2F 0.1 μL、ITS2R 0.1 μL、2×Es TaqMasterMix（Dye）（康为世纪公司）10 μL、ddH2O 8.8 μL、DNA 模板1 μL。在Eppendorf Mastercycler PCR 仪上设定程序:94 ℃预变性5 min，35 个循环（循环条件为94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s），72 ℃终延伸10 min。PCR 完成后，制作1.5%琼脂糖凝胶，取5 μL PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯检测。二次PCR 是将上述PCR 反应体系中的DNA 模板更换为第一次PCR 产物以相同的PCR反应条件进行第二次PCR即可。

1.4.4 改良方法的比较 以试剂盒（上海生工公司，产品编号:B518231）提取DNA 的PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果作为参照，比较12 种改良方法提取DNA的PCR扩增效果的优劣。

2 结果与分析

图1 不同缓冲液与水浴时间互作提取DNA比较Figure 1 Comparion of DNA extraction using interactions of various extraction buffers with different water-bath time

2.1不同缓冲液与水浴时间互作对DNA提取的影响具体结果见图1。利用2×CTAB（含1.4 mol/L或2.5 mol/L NaCl）、1%SDS、生工试剂盒等4种缓冲液对9 种乌头属植物根茎生品和炮制品DNA 进行提取（异丙醇沉淀DNA），提取的DNA 利用ITS2F/ITS2R 进行PCR 扩增，琼脂糖凝胶检测，以试剂盒的提取效果为对照（见图1-A）。结果表明:不同缓冲液与水浴时间互作效应不同，2×CTAB（含1.4 mol/L 或2.5 mol/L NaCl）水浴1 h 或3 h、1%SDS 水浴1 h提取的生品DNA均可成功扩增ITS2片段，其中2×CTAB（含2.5 mol/L NaCl）水浴3 h 提取的9 种乌头生品DNA 的ITS2 扩增效果最佳，见图1-B～F；1%SDS水浴1 h、2×CTAB（含2.5 mol/L NaCl）水浴1 h、2×CTAB（含1.4 mol/L 或2.5 mol/L NaCl）水浴3 h提取的炮制品DNA均可扩增浓度相对较低的ITS2 片段，其中，2×CTAB（含1.4 mol/L NaCl）水浴3 h 提取的9 种乌头生品DNA 的ITS2 扩增效果最佳，见图1-C～F。

图2 PVP和DNA沉降方式对乌头生品和炮制品DNA提取的影响Figure 2 Effects of PVP and DNA sedimentation modes on DNA extraction from crude and preparing products of Aconitum

2.2 1%PVP对DNA提取的影响在2×CTAB（含1.4 mol/L 或2.5 mol/L NaCl）、1%SDS缓冲液中添加1%PVP，对9 种乌头属植物根茎生品和炮制品DNA进行提取，提取的DNA利用ITS2F/ITS2R进行PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明，添加PVP 对生品DNA 提取影响不大，但对炮制品有明显的抑制作用。其中，添加PVP后提取的8～9种乌头生品DNA 均能成功扩增ITS2 片段，而乌头炮制品均未检测到明显的ITS2片段。见图2-A～C。

2.3 1%PVP和DNA沉降方式互作对DNA提取的影响在2×CTAB（含1.4 mol/L 或2.5 mol/L NaCl）、1%SDS 缓冲液中添加1%PVP 对9 种乌头属植物根茎生品和炮制品DNA 进行提取，乙醇+NH4Ac 沉降DNA，提取的DNA 利用ITS2F/ITS2R 进行PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明，添加1%PVP+乙醇+NH4Ac 沉降DNA 对生品DNA 提取影响不大，但对炮制品有明显的抑制作用。其中，添加1%PVP 且进行乙醇+NH4Ac 沉降DNA 后，提取的8 ～9 种乌头生品DNA 均能成功扩增ITS2 片段，而乌头炮制品均未检测到明显的ITS2 片段。见图2-D ～F。

2.4乌头炮制品的ITS2片段二次PCR 对上述12 种方法提取的炮制品DNA 用ITS2F/ITS2R 进行一次PCR 后，以PCR 产物为模板进行ITS2 位点的二次PCR，琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明，除了2×CTAB（含1.4 mol/L NaCl）水浴1 h 和1%SDS 水浴3 h+异丙醇沉淀方法，生工试剂盒和其他10 种方法提取的乌头炮制品DNA 均可通过二次PCR 显著提高ITS2扩增产物浓度。见图3。

3 讨论

图3 乌头炮制品的ITS2片段二次PCRFigure 3 Two-time PCR for ITS2 fragments in preparing products of Aconitum

3.1乌头生品和炮制品DNA提取方法改良DNA提取为乌头药材分子鉴定的第一步，其成功与否直接决定了后续的鉴定程序能否正常进行。在乌头药材产地、市场或企业多以经过长时间蒸煮后的乌头炮制品入药，这类材料的DNA 提取难度远大于叶片或干燥生药。本研究采用基于CTAB 和SDS 的改良方法对9 种乌头的生品和炮制品的DNA提取进行了较为系统的研究。结果表明，不同水浴时间与不同缓冲液结合对提取乌头生品和炮制品DNA 有较大影响，筛选出2×CTAB（含2.5 mol/L NaCl）水浴3 h 提取乌头生品DNA 的ITS2 片段扩增效果最好，而2×CTAB（含1.4 mol/L NaCl）水浴3 h提取乌头炮制品DNA 的ITS2 片段扩增效果相对较好。该结果与崔红光等[17]观点一致。本研究中的生品和炮制品也需要CTAB 法结合较长时间水浴来提高DNA 得率，这与乌头药材本身特性有关。作为根茎类药材，富含纤维、淀粉等物质，适当延长水浴时间可使其组织、细胞得到充分裂解，从而释放核酸。而乌头生品和炮制品对CTAB 缓冲液中NaCl 浓度的反应不同，NaCl 浓度为1.4 mol/L 时更适于提取乌头炮制品DNA，而升高至2.5 mol/L 时适合乌头生品。在药材DNA 提取中高盐溶液的应用是为了去除其中的淀粉、多糖等物质[17，23]，本研究结果进而间接说明乌头生品经过蒸煮后，除了次生代谢产物（生物碱或非生物碱成分）均有了较大的变化[24-25]，其结构物质如淀粉、多糖类等物质也发生了变化。另外，添加1% PVP 或者添加1%PVP 并改变DNA 沉降方式对乌头生品和炮制品DNA 提取有不同程度的抑制作用。前人在DNA 提取过程中添加PVP 浓度各有不同，如在提取富含多酚、多糖等次生物质的药用植物新鲜叶片使用1% PVP 结合0.2% β-巯基乙醇可有效去除杂质和防止DNA 降解[26]，而在提取升麻、楤木、木香、乌药、芍药和木通等根茎类药材DNA 时则在2%CTAB中加入PVP至终浓度6%[27]。本研究结果显示1% PVP 产生了抑制作用，说明1% PVP 可能不适合提取乌头生品和炮制品DNA。虽然前人使用乙醇+NH4Ac 可抑制小片段和低浓度的DNA 分子在延长的低温保存中形成盐沉淀物[28]，但在本研究中未显现出乙醇沉降的优势，原因可能在于1%PVP 的不当比例影响了乙醇沉降的作用。

3.2二次PCR提高乌头炮制品DNA扩增敏感性本研究中乌头炮制品提取的DNA 扩增结果均不理想，即使是相对较好的方法[2×CTAB（含1.4 mol/L NaCl）水浴3 h]提取的炮制品DNA 扩增的ITS2 片段浓度与生品比较还是较低的。若要进行后续的测序等反应，浓度一定是达不到的。目前，二次PCR 多用于临床检测扩增量少的标本或是极微量DNA 标本供后续SSCP 和DNA 测序分析，或是加工食品中成分的核酸检测，此方法的敏感性明显高于一次PCR[22，29-31]；但二次PCR 在药材物种鉴定中还尚未见有报道。本研究中的乌头炮制品是由生品经过长时间蒸煮获得的，其中的DNA 降解程度远超干燥生品，本研究通过二次PCR 可以明显提高乌头炮制品DNA 扩增量，减少DNA 中杂质对PCR 的影响，使其后续的测序等试验得以顺利进行。