富硒西兰花中硒的赋存形态及其抗氧化性

2021-01-21陈清清张泽洲袁林喜朱元元尹雪斌王张民

宜春学院学报 2020年12期

陈清清，张泽洲，袁林喜，朱元元，尹雪斌,2，王张民,2*

(1.苏州硒谷科技有限公司，江苏省硒生物工程技术研究中心，江苏苏州 215000；2．中国科技大学苏州研究院，功能农业重点实验室，江苏苏州 215123；3．宜春学院生命科学与资源环境学院，江西宜春 336000)

硒作为人体必需的微量元素之一，自从其营养价值首次被发现后[1]，缺硒对人体可能引起的疾病成为研究的热点。1973年，Rofruek等[2-3]发现硒是红细胞内谷胱甘肽过氧化物酶的必需组成成分，对磷脂氢过氧化物酶[4]和胞外谷胱甘肽过氧化物酶[5]的结构和功能的进一步研究，结果表明硒是这些酶类的必要成分，并在生物机体内发挥如抗氧化、提高免疫力和保护肝脏等重要作用。大量的研究表明硒营养不足会影响人体正常的生理代谢，会引发包括克山病，大骨节病，贫血性溶血及癌症[6-7]等疾病。因此，每天合理补充硒，保证硒摄入，对满足机体正常的生理代谢很有必要。

1 材料与方法

研究方法依富硒西兰花中营养成分组成及其硒含量、富硒西兰花中四种溶性粗蛋白的组成及其结合态硒含量、四种溶性含硒粗蛋白态中含硒氨基酸的组成、以及四种溶性含硒粗蛋白的自由基清除能力的顺序分别阐述。

富硒西兰花总硒测定参照《食品安全国家标准食品中硒的测定 GB 5009.93-2017》[13]氢化物原子荧光光谱法进行总硒检测分析。

1.1 材料与试剂

研究所用的富硒西兰花由江苏省硒生物工程技术研究中心提供，硒含量为87.5 mg/kg。

研究中所有的试剂半胱氨酸(L-Cysteine)、蛋氨酸(DL-Methionine)、L-硒代半胱氨酸(L-selenocysteine)、L-硒代蛋氨酸(L-selenomethionine)标样、2，3-二氨基萘(DAN)(2, 3-diaminaphthalene (DNA))和D-脱氧核糖(D- Deoxyribose)购自Sigma-Aldrich公司。其他试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司，主要包括抗坏血酸、邻苯三酚、2-硫代巴比妥酸(2-Thiobarbituric acid，TBA)、三氯化铁(FeCl3)和过氧化氢(H2O2)。

1.2 实验仪器与设备

9230型原子荧光分光光度计、液相色谱-原子荧光联用形态分析仪、紫外可见分光光度计、台式冷冻离心机、pH计、数显恒温振荡器、磁力搅拌器、超声波清洗器。

1.3 实验方法

以下所有实验数据重复测定3次，

1.3.1 样品预处理

富硒西兰花样品用超纯水洗净后，于55℃烘箱中烘干，粉粹机磨碎后过40目筛制成标准粉，干燥器内保存待用。

1.3.2 富硒西兰花含硒营养成分的提取

1)核酸硒的提取

取西兰花样品10 g，加入2 mol/L的NaCl 溶液100 mL，沸水浴中提取，重复三次，合并上清液，氯仿-异戊醇法除去蛋白质后，调节pH至2.0，放于冰箱中静置24 h，离心后得核酸沉淀，用95%乙醇淋洗沉淀三次，烘干后测定硒含量。

2)多糖硒的提取

在1)西兰花残渣中加入3%的草酸溶液100 mL，沸水浴中提取，重复三次，合并滤液及1)操作中的废液，氯仿-异戊醇法除去蛋白质后，加入95%的乙醇500 mL，静置24 h，离心后得到多糖沉淀，用85%乙醇洗涤沉淀三次，烘干后测定硒含量。

3)蛋白质硒的提取

取10 g西兰花样品加入0.25 mol/L的NaOH溶液200 mL，50℃水浴中提取8h。在浸提液中缓缓加入(NH4)2SO4晶体至95%饱和，冰箱中静置2 h，离心得蛋白质沉淀，乙醇-乙醚混合液(2：1)洗涤沉淀三次，烘干后测定硒含量。

1.3.3 含硒粗蛋白的逐级提取与硒形态分析

制备富硒西兰花冻干粉：

西兰花样品用超纯水洗净后，冷冻干燥，最后采用粉粹机磨碎，过40目筛制成粉，干燥器内保存待用。

1)水溶性含硒粗蛋白的制备

取50 g富硒西兰花冻干粉，加入超纯水1000 mL，冰水浴中置于磁力搅拌器搅拌8h，4℃低温离心后，取上清液，残渣再次加入1000 mL超纯水后，重复上述操作一次，离心后取上清液，合并两次上清液，添加(NH4)2SO4晶体至饱和状态，随后放入冰箱，温度为4℃静置24 h，离心后收集沉淀转入透析袋，放入超纯水中透析，直至用饱和BaCl2溶液检验透析水中为阴性，将透析水进行真空冷冻干燥，制备水溶性含硒粗蛋白晶体，并检测硒浓度。

2)盐溶性含硒粗蛋白的制备

在1)提取后剩余的残渣中，加入1000 mL、0.5 mol/L的NaCl溶液，冰水浴中置于磁力搅拌器中搅拌8 h，除了加入(NH4)2SO4至半饱和，其他操作与水溶性蛋白提取相同。

3)醇溶性含硒粗蛋白的制备

在2)提取的残渣中加入75%的乙醇1000 mL，冰水浴中置于磁力搅拌器搅拌8 h，除了不加入(NH4)2SO4，其他操作与水溶性蛋白提取相同。

4)碱溶性含硒粗蛋白的制备

在3)提取的残渣中加入0.1 mol/L的NaOH溶液1000 mL，冰水浴中置于磁力搅拌器中搅拌8 h，除了加入(NH4)2SO4至半饱和，其他操作与水溶性蛋白提取相同。

1.3.4 四种溶性含硒粗蛋白中的硒形态分析

称取1)、2)、3)和4)制备的四种粗蛋白各称取0.1 g，分别加入5 mL Tris-HCl超声30 min后，依次加入纤维素酶，蛋白酶K，蛋白酶XIV，放入恒温振荡器中酶解，氢化物原子荧光光谱与液相色谱联用分析蛋白酶解后的含硒氨基酸形态。

1.3.5 含硒粗蛋白对自由基的清除

1)含硒粗蛋白羟基自由基(·OH)的清除

分析1.3.3制备的四种粗蛋白对·OH的清除能力，采用D-脱氧核糖(DR)法[14]：在10 mL离心管中依次加入0.4 mL的KH2PO4-KOH缓冲液， 0.2、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5mg/mL的蛋白样品液0.1 mL，然后顺序加入1.04 mmol/L的 EDTA 溶液、1 mmol/L的 FeCl3溶液、12 mmol/L 的H2O2溶液、60 mmol/L D-脱氧核糖(DR)溶液和2 mmol/L抗坏血酸溶液各0.1 mL，最后加入超纯水，定容至1.0 mL。随后置于37℃的恒温水浴锅中1 h，取出后迅速加入25%的HCl溶液和1% 的TBA 溶液各1.0 mL，置于100 ℃沸水中加热15 min，取出、冷却。若有混浊，置于离心机，调至10000 r/min离心15min，取上清液。选择波长为532nm，测定吸光度。·OH清除率按公式(1)计算：

·OH清除率(%)

=[1-(A1-A2)/A0]×100%

(1)

其中A0：为空白液吸光度；

A1：为加入清除剂和D-脱氧核糖(DR)后吸光度；

A2：样品吸光度。

(2)

其中As：对照组，不含待测物时吸光度；

Ac：试样组，含待测物吸光度。

1.4 统计分析

论文中相关性分析、单因素方差分析和差异显著性分析，采用SPSS 17.0 统计分析。采用sigma plot 12.5软件绘制图、表。

2 结果与分析

2.1 富硒西兰花中含硒营养成分分布规律

测定富硒西兰花中核酸、多糖、粗蛋白和其他物质中硒含量，由图1可知，硒在富硒西兰花中主要以蛋白硒形式存在，约占总硒含量的90.2%～91.5%，核酸硒与多糖结合硒量很少，不到总硒含量的5%，其他形式的硒约占4%。这与硒生物强化技术得到的其他富硒生物材料如富硒小麦、富硒玉米等相似[15-16]，即硒主要赋存为含硒粗蛋白。

图1 富硒西兰花中硒的主要结合形式与含量

2.2 四种溶性含硒粗蛋白中硒含量与形态分析

采用超纯水、NaCl溶液、乙醇和NaOH溶液顺序分离出水溶性、盐溶性、醇溶性和碱溶性蛋白并测定硒含量，分了这四种溶性粗蛋白的比例，以及含硒粗蛋白的主要类型，其中四种溶性含硒粗蛋白的硒含量总和为富硒西兰花的粗蛋白结合态硒的总硒含量。由表1数据结果，提取的可溶性蛋白中主要为水溶性蛋白和碱溶性蛋白，分别占25.9%、65.4%，但是盐溶性蛋白和醇溶性蛋白所占比例较低，总共不到10%。其中蛋白结合硒量较高的为水溶性蛋白，碱溶性蛋白，水溶性蛋白结合硒量最高，约为415.7 mg/kg，占含硒粗蛋白总硒的比例也最高约为57.9%。其次是碱溶性蛋白结合硒量为245.3 mg/kg，占比为34.2%，盐溶性蛋白和醇溶性蛋白结合硒量最少。

表1 四种溶性粗蛋白结合态硒的硒含量

将研究载体富硒西兰花与其他研究载体富硒大蒜和富硒花生中四种含硒粗蛋白的结果相比较。岳晶念等发现富硒大蒜中水溶性蛋白为主要赋存形态，占可溶性蛋白总量的62.24%，且四种含硒溶性蛋白结合态的硒含量水溶性蛋白最高、碱溶性蛋白次之、醇溶性蛋白最低，而盐溶性蛋白位于碱溶性和醇溶性蛋白之间[17]，这与论文中富硒西兰花结果一致。而富硒花生中碱溶性蛋白为可溶性蛋白的主要存在形式，检测后，其蛋白结合态硒含量也远远超于其他溶性蛋白，可达总蛋白结合态硒总量的93%[18]。

采用原子荧光与高效液相色谱连用连续分析富硒西兰花中水溶性、盐溶性、醇溶性和碱溶性蛋白由图2可知，四种不同溶性含硒蛋白中主要硒氨基酸形式为硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代半胱氨酸(Secys)、四价硒(Se4+)、硒甲基半胱氨酸(SeMecys)。其中水溶性蛋白中以Secys形式含量最高，约占38.4%，其次是SeMet(30.5%)、SeMecys(28.6%)，Se4+含量最低(2.3%)。碱溶性蛋白中以SeMet形式含量最高，约占40.4%，其次是Secys(32.5%)、SeMecys(25.8)，Se4+含量最低(1.1%)。盐溶性蛋白和醇溶性蛋白主要硒氨基酸形式为SeMet、Secys，占总比例90%以上。这与其他研究载体富硒酵母、富硒小麦和富硒玉米等的硒氨基酸形态一致，含硒粗蛋白中硒代蛋氨酸为主要赋存形态，富硒酵母超过90%[19]，富硒小麦约90%[20]，富硒玉米超过95%[21]。