小鼠胚胎移植影响因素的初步探索

桂 飞，杨伟伟，孙筱品，顾美儿

（杭州师范大学实验动物中心，杭州 310036）

目前，转基因小鼠品系已被广泛应用，但在病原微生物控制、冷冻保种、品系复苏和快速扩增繁殖等方面仍面临很大的挑战。其中，通过体外受精获得大量胚胎，并采用胚胎移植方法成功植入受体雌鼠输卵管，这是病原微生物控制和辅助生殖过程中不可或缺的一项技术[1]，既可以达到生物净化的目的，有效控制病原微生物的感染[2-3]，同时也可以实现快速扩增繁殖，获得大量子代小鼠。影响胚胎移植的因素有很多：一方面，不同品系之间的胚胎存在差异[4]，其中近交系胚胎更敏感，存活率更低[5]；另一方面，子宫承受能力也会影响移植成功率，包括单侧或者双侧移植、移植胚胎数量等因素[6]。本研究基于本中心过去几年的胚胎移植实验数据，分析影响胚胎移植的主要因素，以期探索更加高效的实验策略，为小鼠胚胎移植提供一定的指导。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验所用APPSWE、SYN-a30p、Sox10-DTA、GFAP-creER、P53flox、ErbB2、MHC-cko、Sox10和Nrn1等277个基因修饰小鼠品系的雄鼠均由杭州师范大学医学院和生命科学院邱猛生、张遵义、刘阳、陶艳梅、鞠振宇、刘俊平和杨磊等多个课题组提供，每个品系1～2只，8～12周龄。工具鼠：4周龄C57BL/6供体雌鼠，用于超数排卵，提供卵母细胞，每个品系5只；ICR结扎雄鼠150只，8～12周龄，用于与ICR受体雌鼠交配获得假孕雌鼠；6～8周龄ICR假孕雌鼠，用于胚胎移植，每个品系3只。所有工具鼠均由杭州师范大学实验动物中心提供[SCXK（浙）2016-0004]。所有小鼠均饲养于杭州师范大学实验动物中心屏障环境中[SYXK（浙）2016-0006]，可以自由采食和饮水。待动物充分适应环境后，在符合动物福利伦理的条件下进行实验，伦理审批编号为2019175。

1.2 主要试剂

孕马血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，hCG）均购自宁波市三生药业有限公司。苯巴比妥钠购自福建闽东力捷讯药业股份有限公司。M2培养液购自美国Thermo公司，精子获能液TYH（Toyodo Yokojama and Hoshi）和人输卵管培养液（human tubal fluid，HTF）等系本实验室自制[7-8]。

1.3 主要仪器与设备

体式显微镜为日本Nikon公司产品。二氧化碳培养箱和生物安全柜为美国Thermo公司产品、超净工作台为苏净集团苏州安泰空气技术有限公司产品。恒温热台为上海蔡康光学仪器有限公司产品，电子天平为德国Sartorius公司产品。移卵针为北京正天易科贸有限公司产品。吸卵管参照文献[9]改良制作，其中所用橡胶软管和0.22 µm过滤器均经过严格的消毒灭菌处理，将过滤器两端连接橡胶软管后，检测气密性良好即可使用。

1.4 胚胎收集

本研究所用277个基因修饰小鼠的背景品系均为C57BL/6，所以选用C57BL/6供体雌鼠进行超数排卵，腹腔注射一定剂量（5～10U/只）的PMSG，46～48 h后对应注射等量的hCG。12～14h后，以颈椎脱臼法处死供体雌鼠，切开腹部，取出输卵管，从壶腹部分离取出卵丘卵母细胞复合体，置于HTF培养滴中，置于CO2体积分数为5%、37℃培养箱中孵育。

在生物安全柜中，以颈椎脱臼法处死雄鼠，切开腹部，暴露出雄鼠睾丸和附睾等组织，分离出附睾，刺破/剪破后取出精液，置于TYH培养滴中，置于CO2培养箱中孵育30～60 min。光学显微镜下观察精子的活力和状态，根据精子状态，取适量的精子滴于孵育好的卵母细胞培养滴中，进行体外受精。

受精后4 h左右，更换培养液，清洗胚胎3次后，继续放在CO2培养箱中培养至次日上午，于显微镜下挑选出成功受精的2-细胞胚胎，分选并统计数量，计算体外受精率。体外受精率＝受精后的2-细胞数/总卵母细胞数×100%。

1.5 胚胎移植

移植前1 d将ICR受体雌鼠与结扎雄鼠合笼处理，根据所需受体雌鼠数量，按照25%见栓率进行合笼。第二天早上进行检栓操作，见栓的受体即为假孕雌鼠。

将假孕受体雌鼠麻醉，剃除腹部毛发，在此处剪开小口，用镊子取出输卵管，用止血夹夹住脂肪垫固定输卵管位置。用嘴吸式移植针吸取2-细胞胚胎20枚，在体式显微镜下移植至单侧或双侧输卵管的壶腹部前段。移植完成后，缝合手术创口，置于恒温热台，待受体雌鼠苏醒后，再饲养于笼盒中。移植后14d，即可观察移植受体雌鼠是否妊娠，妊娠率＝妊娠雌鼠数/移植受体雌鼠总数×100%。移植后19～21 d，小仔出生，即可统计窝产仔数和产仔率，窝产仔率＝窝产仔数/移植胚胎数×100%。由于胚胎不发生经子宫迁移，因此本实验对比单侧移植和双侧移植的效果，拟通过双侧移植的方法减轻子宫负荷。实验分别将每个转基因品系的胚胎单侧移植20枚至受体雌鼠一侧的输卵管内，双侧移植则是在受体雌鼠的两侧输卵管内分别移植入10枚同一品系胚胎，移植完成后缝合创口，置于热台待其苏醒后单独饲养，观察小鼠妊娠及产仔情况。

1.6 统计学方法

运用SPSS 19.0软件进行统计学处理。277个品系分组后，每个品系至少移植3只受体鼠，结果数据以表示。使用卡方检验来分析体外受精率是否与妊娠率及窝产仔率相关。采用单因素方差分析和事后Tukey’s多重比较检验分析移植胚胎数和窝产仔数是否相关。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同受精率品系对移植后窝产仔率的影响

按照体外受精率不同，将277个品系分为0%～39%、40%～59%、60%～69%、70%～79%、80%～89%、90%～100% 共 6组进行统计。结果（表1）发现，胚胎移植后各组间妊娠率没有明显差异（均P＞0.05）。体外受精率在0%～39%的品系窝产仔数（4.61±1.92）和产仔率（19.21%±9.70%）均显著低于其他各组（均P＜0.01）；体外受精率在60%～69%的品系窝产仔率最高[（30.89±10.53）%]，而90%～100% 组[（25.57±9.36）%]比60%～69%组的窝产仔率明显降低（P＜0.05）；其余各组间未见明显差异（均P＞0.05）。结果表明，体外受精率低于40% 的品系胚胎移植后的产仔率明显降低，平均每只受体产仔数也明显减少。

表 1 不同受精率品系对移植后窝产仔率的影响Table 1 Effect of mouse strains with different fertility rate on the litter rate after transplantation(，n=3)

表 1 不同受精率品系对移植后窝产仔率的影响Table 1 Effect of mouse strains with different fertility rate on the litter rate after transplantation(，n=3)

注：#根据不同品系小鼠的体外受精率进行分组。与其他各组比较，**P<0.01；与60%～69%组比较，*P<0.05。

组 别# 品系/个 受精率/% 妊娠率/% 窝产仔数/只 产仔率/%0%～39%40%～59%60%～69%70%～79%80%～89%90%～100%18 20 29 51 106 53 21.87±12.13 51.53±5.74 66.07±2.68 75.31±3.00 85.06±2.95 93.58±2.68 84.35±21.08 (49/60)86.65±25.21 (38/60)79.82±29.84 (48/73)86.02±37.52 (86/154)84.73±23.31 (245/297)85.06±19.54 (97/151)4.61±1.92**6.70±2.11 7.14±1.78 6.55±2.03 6.17±1.71 6.06±1.60 19.21±9.70**28.46±12.98 30.89±10.53 28.26±13.46 26.32±11.57 25.57±9.36*

2.2 移植胚胎数量对窝产仔率的影响

不同数量胚胎的移植结果（表2）显示，移植胚胎数较少（5枚）时，可以成功使受体妊娠，但是可能发出维持妊娠所必需的信号不足[10-11]，导致雌鼠母性较差，小仔出生后容易发生食仔的现象，小仔存活率较低。移植胚胎数在10枚以上时，各组窝产仔数和产仔率均较高；其中，胚胎移植数量在15枚左右时产仔率最高，达到（46.67±11.56）%，均明显高于其他各组（均P＜0.01），表明此时胚胎利用率最大。移植数量达到25枚时，平均每只移植受体小鼠的产仔数最多（9.67±1.53），均明显多于其他各组（均P＜0.01）。移植胚胎数继续增加到30枚后，窝产仔数（8.33±0.58）和产仔率[（27.33±2.31）%]均有所下降，表明此时已超过小鼠子宫能承受的最大负荷。因此，移植胚胎数在15枚左右时利用率最大，移植胚胎数在25枚左右时获得子代小鼠数量最多，此时子宫承载能力几乎达到最大。

2.3 单侧移植和双侧移植的比较

统计分析基因修饰品系Sox10的实验结果，发现单侧移植和双侧移植的窝产仔数分别为（4.75±0.96）只和（5.33±0.58）只，产仔率分别为（26.25±7.50）%和（26.67±2.88）%，单侧移植和双侧移植之间无明显差异（P＞0.05）。同时还对TLR4等多个品系进行了相应的实验，发现单双侧移植的比较趋势均与Sox10品系一致。

表 2 移植胚胎数量对窝产仔率的影响Table 2 Effect of the number of transfer red embryo on the litter rate(x- ± s，n=3)

3 讨论

转基因小鼠的背景品系比较复杂[10]，但大多采用C57BL/6品系。本研究中选用的277个小鼠品系的遗传背景均为C57BL/6，研究发现这些品系的体外受精率不同对胚胎移植后受体妊娠率没有明显影响，但当受精率在40%以下时受体平均窝产仔数和产仔率均显著降低，表明受精率较低的品系获得的2-细胞胚胎质量也可能受到一定的影响，胚胎发育受阻，导致产仔率降低。体外受精率较低的品系，建议适当增加移植胚胎或受体的数量，以获得足够量的子代小鼠。另外，本研究还发现，不同品系之间存在一定的差异，大部分受精率低于40%的品系窝产仔数和产仔率均明显降低，但极少数品系如Erf、Rosa-eGFP-DTA等的受精率较低，而胚胎移植后窝产仔率较高。目前，人们对造成这种现象的具体原因尚不清楚，有待进一步实验研究。

本研究还发现，移植胚胎数较少（5枚）时，移植受体可以成功妊娠，但是由于出生小鼠数量较少，小仔出生后，容易发生食仔的现象，小仔存活率较低。Dorsch等[6]研究发现，移植胚胎数在3～5枚时，可使移植受体成功妊娠，与本研究结果相一致。另有文献报道，胎盘只有在蜕膜化后才能维持妊娠，而小鼠和大鼠中只有囊胚存在时才发生妊娠，可能3～5个胚胎不足以发出维持妊娠所必需的信号[11-12]。然而这些研究报道仍不能解释本研究中移植3～5枚即可发生妊娠的现象。

移植胚胎数在10枚以上时，各组窝产仔数和产仔率均较高。其中，胚胎移植数量在15枚左右时窝产仔率最高，达到（46.67±11.56）%，表明此时胚胎利用率最大。移植数量达到25枚时，平均每只移植受体小鼠的产仔数（9.67±1.53）最多。移植胚胎数继续增加到30枚后，窝产仔数（8.33±0.58）和产仔率[（27.33±2.31）%]均有所下降，表明此时已超过小鼠子宫能承受的最大负荷。Dorsch等[6]研究表明，移植新鲜胚胎数在18～20枚时，移植效果最好；当移植胚胎数＞21枚时，窝产仔数和产仔率均会出现大幅下降，这与本研究结果有一定的差异。雌性小鼠共有5对乳房，故产仔数控制在10只以内，对小仔后续的生长发育比较有保障。Johnson等[13]提出一种“子宫容量”的观点，他们认为子宫的容量超过一定极限后，就不能再维持胚胎的发育，这在一定程度上可解释本实验中发现的现象：当移植胚胎数达到30枚以上时，窝产仔数和产仔率均降低。

已有研究表明，胚胎不发生经子宫迁移[14]。因此，本实验还对比了单侧移植和双侧移植的效果，考虑采用双侧移植的方法减轻子宫负荷。然而分析结果表明，单侧移植和双侧移植后的窝产仔数和产仔率均未见明显差异。双侧移植需要在左右两侧均进行移植手术操作，较单侧移植的操作难度大，对动物创伤也比较大，这可能会影响动物的妊娠率，故笔者建议采用单侧移植即可。本实验结果与Mahabir等[15]的研究结果相一致：单、双侧移植的效果未见显著性差异。另外，需要说明的是，本实验中部分品系的样本量不足，无法将其一起统计，后续将进一步补充研究。