基于网络药理学探究白藜芦醇抗大鼠心肌缺血再灌注损伤的分子机制

张晓节，蒋 磊

（安徽省第二人民医院药学部，合肥 230041）

急性心肌梗死是冠状动脉急性或持续性缺血缺氧导致心肌组织坏死。心肌细胞大量死亡，严重影响患者的预后。心肌缺血再灌注（myocardial ischemia-reperfusion，MI/R）损伤是指心肌短时间内供血不足或停止，之后又恢复供血，进而造成心肌组织损伤的过程[1]。研究表明，导致MI/R损伤的机制包括细胞坏死、细胞凋亡、钙超载，以及过量氧自由基的产生等[2-4]。目前，治疗MI/R损伤的有效药物尚不完全明确。

白藜芦醇（resveratrol，RSV）是存在于桑树、花生或朝鲜槐等多种植物中的一种非黄酮类多酚化合物。既往研究证实，RSV能够通过减少MI/R损伤、舒缓血管或者抗动脉粥样硬化等途径发挥保护心血管系统的作用[5-6]。然而，有关RSV治疗MI/R损伤的具体分子机制尚不清楚。网络药理学是基于整体构想，通过构建多层次的复杂网络，发现关键节点即关键靶基因，然后以此对疾病的发病机制和药物干预作用机制进行有效预测。

本研究采用网络药理学信息筛选方法，从RSV治疗MI/R损伤的整体分子作用角度出发，探寻RSV治疗的有效靶基因，然后通过动物体内实验验证RSV治疗MI/R损伤的分子机制，为RSV应用于临床治疗提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠30只，体质量为（200±20）g，6～8周龄，由安徽医科大学实验动物中心提供[SCXK（皖）2017-001]。所有大鼠在25 ℃左右、相对湿度为40%～70%的环境[SYXK（皖）2017-004]中适应性饲养7 d，然后进行动物实验。本实验方案通过安徽医科大学动物伦理委员会审核批准（IACUC：20170625006）

1.2 药物与试剂

RSV粉末（纯度高于99%）和戊巴比妥钠（批号：57-33-0）均购自美国Sigma公司；蛋白质印迹法检测用兔抗caspase-3单克隆抗体（#9662）和小鼠抗Bcl-2单克隆抗体（#3498）均购自美国Cell Signaling Technology公司，小鼠抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）单克隆抗体（15497-1-AP）购自中国武汉三鹰生物技术有限公司；兔抗GAPDH单克隆抗体（AF5009）、一抗稀释液、二抗稀释液、HE染色试剂盒和TUNEL染色试剂盒均购自碧云天生物技术研究所；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗和山羊抗鼠二抗均购自武汉博士德生物工程有限公司；小鼠抗TRAIL一抗免疫组织化学检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。大鼠血浆中乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase，LDH）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）和心肌肌钙蛋白Ⅰ（cardiac troponinⅠ，cTnⅠ）含量测定用试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

1.3 RSV与MI/R损伤靶基因筛选及调控网络图构建

通过中药系统药理学数据库（https://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）筛选得到RSV有效作用靶基因，然后采用GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）筛选得到MI/R损伤相关靶基因。最后运用R语言软件包中的VennDiagram程序包，对RSV作用与MI/R损伤相关的靶基因取交集，再利用Cytoscape软件（https://cytoscape.org/），导入这些交集基因，构建基因调控网络。

1.4 GO功能富集分析和KEGG通路分析

运用R语言软件包中的String和Colorspace程序包，对基因调控网络进行GO功能富集分析，并画出关键基因的富集分析柱状图及气泡图。使用模糊聚类算法，以注释共同度为基础，对基因进行聚类计算，得出聚类分值，该分值代表该基因在基因调控网络中的重要性。然后根据GO富集分析结果，运用R语言软件包中的Bioconductor程序包，进行KEGG通路分析，得到RSV治疗MI/R损伤涉及的主要信号通路。采用超几何分布设计法进行KEGG富集分析，富集分析的显著性按照Benjamini-Hochberg校正法进行计算。

1.5 动物建模与分组

实验大鼠随机分为3组，即假手术组（Sham组）、心肌缺血再灌注组（MI/R组）及药物治疗组（RSV组），每组各10只。采用戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，取仰卧位固定，大鼠四肢通过肢体导联针与呼吸机连接，记录Ⅱ导联心电图，分离左侧冠状动脉。Sham组只穿线不结扎左冠状动脉前降支；MI/R组和RSV组结扎左冠状动脉前降支约40 min，然后松开结扎线再灌注2 h。在整个过程中，以缺血时心肌组织变白且心电图ST段抬高，再灌注时心肌变红且ST段下降，视为造模成功。RSV组大鼠于舌下静脉滴注用生理盐水（即0.9%氯化钠溶液）配制的RSV溶液（10 mg/kg），而Sham组和MI/R组均注射等量的生理盐水。

1.6 血浆中 LDH、CK和cTnⅠ含量测定

对各组大鼠心脏取血，并将收取的血液放置于抗凝离心管内，4 ℃ 3 000 r/min离心10 min，吸取上清液。按照试剂盒操作说明书检测大鼠血浆中LDH、CK和cTnⅠ的含量，酶标仪测定吸光度值，以此反映大鼠MI/R损伤后的心肌功能。

1.7 大鼠心肌梗死面积检测

颈椎脱臼法处死大鼠，取各组大鼠心脏。垂直心脏长轴，顺心尖向底部的方向将心脏组织切片，切片厚度为5µm。将切片置于37 ℃、pH为7.4的TTC溶液中染色10 min，然后用4%的多聚甲醛溶液固定。缺血心肌组织呈现白色，正常的心肌组织为血红色，心肌梗死面积相对百分比＝白色区域面积/血红色区域面积×100%。

1.8 HE染色观察心肌结构

取大鼠心肌组织，用4%的多聚甲醛溶液进行固定，再用不同体积分数的乙醇溶液梯度脱水，然后用二甲苯进行组织透明，最后经石蜡包埋，切片。使用HE染色试剂盒，根据试剂盒操作说明进行HE染色。光学显微镜下观察心肌组织结构。

1.9 TUNEL染色观察心肌细胞凋亡

将大鼠心肌组织的石蜡切片置于60 ℃烤箱内脱蜡，然后使用二甲苯浸洗2次，每次约5 min。之后用梯度乙醇溶液（100%、95%、80%、70%）清洗各1次，每次约3 min。采用Proteinase K工作液处理心肌组织切片20 min，并在室温条件下加入细胞通透液孵育10 min。PBS清洗切片，滴加TUNEL反应混合液，反应30 min。切片风干后，加入50 µL的 Converter-POD，加上盖玻片，37 ℃孵育30 min。PBS清洗切片后，加入DAB显色液，孵育10 min，光学显微镜下观察TUNEL阳性细胞数目并拍照。细胞凋亡率（%）＝TUNEL阳性细胞数目/细胞总数目×100%。

1.10 免疫组织化学法检测TRAIL蛋白表达

将大鼠心肌组织的石蜡切片置于60 ℃烤箱内脱蜡，然后二甲苯浸洗，梯度乙醇溶液脱水。将心肌组织切片置于10 nmol/L的柠檬酸盐缓冲液中，90 ℃抗原修复30 min。室温条件下，自然冷却并用去离子水缓慢冲洗。采用3%的H2O2溶液孵育10 min后，加入10%的BSA溶液封闭20 min。加入小鼠抗TRAIL单克隆抗体（工作液体积稀释比例为1∶200），4℃条件下孵育过夜。加入山羊抗小鼠二抗，室温条件下孵育30 min。滴加DAB显色液，显色后拍照，观察心肌组织中TRAIL蛋白表达情况。

1.11 蛋白质印迹法检测caspase-3、Bcl-2和TRAIL表达

取大鼠心肌组织，PBS润洗1～2次，加入细胞组织裂解液（体积比为1∶5），冰上裂解1 h；4℃，12 000×g离心15 min，收集上清液，采用BCA法进行蛋白质定量检测；然后取心肌细胞总蛋白30µg，上样至聚丙烯酰胺凝胶，80 V电泳30 min后，转120 V电泳60 min，溴酚蓝指示电泳至凝胶最底层。依据蛋白质指示marker和目的蛋白分子量大小，切取目的胶条，采用湿转法将目的蛋白转移至PVDF膜上，转膜时长2h。用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入兔抗caspase-3单克隆抗体（1∶1 000）、小鼠抗Bcl-2单克隆抗体（1∶1 000）、小鼠抗TRAIL单克隆抗体（1∶1 000）和兔抗GAPDH（1∶5 000）单克隆抗体，4℃孵育过夜；再加入对应的山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗，室温孵育1 h；摇床上加入TPBS洗涤3次，5min/次，然后加入显影液，显影并拍照。结果以各目的条带灰度值与内参GAPDH条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.12 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行统计结果分析。动物体内实验检测均独立重复3次，结果数据用表示，多组间比较采用单因素方差分析方法，组内两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RSV作用与MI/R损伤靶基因交集及其调控网络

通过对RSV作用的128个药效靶基因和MI/R损伤的1 231个基因靶点进行基因交集筛选，得到86个可能与RSV治疗MI/R损伤相关的基因作用靶点（图1A），其中包括PTGS1、PTGS2、MAOB、RELA、STAT3、AKT1、VEGFA、CCND1、Bcl-2、Bcl-2-L1和caspase-3等。然后通过Cytoscape软件成功构建RSV治疗MI/R损伤的相关基因调控网络，如图1B所示。

图 1 RSV作用靶点和MI/R损伤相关基因的交集筛选图（A）及其调控网络图（B）Figure 1 Intersection screening diagram (A) and regulation network diagram (B) of resveratrol (RSV) target genes and myocardial ischemia-reperfusion (MI/R) damage-related genes

2.2 相关靶基因的GO富集功能与KEGG富集信号通路

GO富集分析可得到特定功能层次上由基因或蛋白数目构成的有向无环图，其中包括分子功能、细胞组分及生物过程3个方面。如图2A所示，筛选得到的86个相关基因主要富集在细胞因子受体结合（cytokine receptor binding）、磷酸酶结合（phosphatase binding）、蛋白磷酸酶结合（protein phosphatase binding）、抑制转录因子结合（repressing transcription factor binding）和激活转录因子结合（activating transcription factor binding）等功能。

采用R语言软件包对筛选得到的86个靶基因进行KEGG信号通路富集分析。结果显示共有157条信号通路，涉及参与糖尿病并发症调控的AGE-RAGE信号通路、卡波肉瘤相关性疱疹病毒感染通路和细胞凋亡信号通路（图2B）。其中细胞凋亡信号通路涉及的主要基因包括TRAIL、caspase-3、Bcl-2及Bax等（图2C）。

2.3 RSV对大鼠心肌功能的影响

如表1显示，与Sham组相比，MI/R组大鼠的血浆中LDH、CK和cTnⅠ含量均明显增加（P＜0.01），心肌梗死面积也明显增大（P＜0.01）；而相比于MI/R组，在给予RSV药物干预后，大鼠心肌功能得到明显改善，血浆LDH、CK和cTnⅠ含量均明显降低（P＜0.01），心肌梗死面积明显减少（P＜0.05）。

2.4 RSV对大鼠心肌结构的影响

HE染色结果显示：Sham组心肌结构正常；MI/R组大鼠的心肌纤维排列紊乱，且部分肌丝断裂，间隙增宽；相比于MI/R组，RSV组大鼠的心肌纤维排列较为规则，心肌间隙变小，心肌细胞变形恢复较好（图3）。

2.5 RSV对大鼠心肌细胞凋亡的影响

TUNEL染色结果（图4）显示：相比于Sham组，MI/R组大鼠心肌细胞凋亡指数明显升高（P＜0.05）；相比于MI/R组，RSV组大鼠心肌细胞凋亡率明显降低（P＜0.05）。蛋白质印迹法检测结果（图5）显示：相比于Sham组，MI/R组大鼠心肌组织中caspase-3表达明显上调（P＜0.05），而Bcl-2表达明显下调（P＜0.05）；相比于MI/R组，RSV组大鼠心肌组织中caspase-3表达明显下调（P＜0.05），而Bcl-2表达量明显增加（P＜0.05）。

图 2 关键靶向基因的GO富集分析（A）和KEGG富集分析（B）柱状图以及细胞凋亡信号通路图（C）Figure 2 GO enrichment analysis (A) and KEGG enrichment analysis (B) histogram of key target genes and their related apoptosis signaling pathways (C)

表 1 RSV对MI/R大鼠心肌功能的影响Table 1 The effect of resveratrol (RSV) on the myocardial function of myocardial ischemia-reperfusion(MI/R) damaged rats(x- ± s, n=6)

图 3 HE染色检测大鼠心肌组织形态学变化Figure 3 Morphological changes of rat myocardium tissues after HE staining

图 4 TUNEL染色检测大鼠心肌细胞凋亡（×200）Figure 4 Apoptosis of rat cardiomyocytes after TUNEL staining (×200)

图 5 蛋白质印迹法检测RSV对心肌组织中凋亡相关蛋白表达的影响Figure 5 Effect of resveratrol (RSV) on the expressions of apoptosis-related proteins in rat myocardium by Western blotting

2.6 RSV对TRAIL蛋白表达的影响

免疫组织化学法检测结果（图6A）显示：MI/R组大鼠心肌组织中TRAIL蛋白表达量增加，而给予RSV药物处理后TRAIL表达水平降低。蛋白质印迹法检测结果（图6B）显示：相比于Sham组，MI/R组TRAIL蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）；相比于MI/R组，RSV组TRAIL蛋白表达水平明显降低（P＜0.01）。

图 6 RSV对大鼠心肌组织中TRAIL蛋白表达的影响Figure 6 Effects of resveratrol (RSV) on the expression of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL) protein in rat myocardium

3 讨论

RSV是一种天然多酚类化合物，广泛存在于多种植物中，具有抗心血管疾病和抗肿瘤等多种生物活性。以往研究发现，在大鼠MI/R损伤模型中，RSV能有效缩短室性心动过速及室颤发生的持续时间，改善心肌损伤[7]。另外，RSV也能够通过抗氧化、抗自由基作用，减少心肌细胞坏死[8]。RSV还能通过调控一氧化氮合酶/一氧化氮（NO）通路，促进NO释放，发挥对MI/R损伤的保护作用[9]。

已知氧化应激在MI/R损伤中扮演重要作用。有文献显示，在MI/R损伤大鼠模型中，心肌细胞线粒体功能出现严重损伤，活性氧产生量异常增加，导致心肌梗死面积增大；而用RSV预处理MI/R损伤模型大鼠后，心肌细胞线粒体功能得到明显改善[10]。同时，炎性反应是MI/R损伤的重要病理生理学机制[11]。在MI/R损伤的大鼠模型中炎性细胞因子水平显著升高，而给予RSV处理后上述炎性细胞因子水平明显降低，提示通过早期的RSV处理抑制炎性反应，能够有效地减轻MI/R损伤[12]。

在上述文献研究的基础上，本研究通过网络药理学预测RSV治疗MI/R损伤的关键靶基因。结果发现：用TCMSP数据库筛选得到RSV作用有效基因靶点共128个，用GeneCards筛选得到MI/R损伤相关靶基因共1 231个，两者交集后共有86个可能成为RSV治疗MI/R损伤的相关基因，其中包括Bcl-2、caspase-3和TRAIL等。以往研究表明，RSV能够通过抑制caspase-3活性，促进Bcl-2蛋白表达，进而降低心肌细胞凋亡率，减轻MI/R损伤[13-14]。本研究进一步采用Cytoscape软件成功构建了RSV治疗MI/R损伤的基因调控网络拓扑图，涉及86个关键靶基因。通过GO功能富集分析发现，关键靶基因主要富集在细胞因子受体结合、磷酸酶结合、蛋白磷酸酶结合和抑制转录因子结合等生物学功能，而KEGG通路富集共涉及157条信号通路，其中排在前3位的是参与糖尿病并发症调控的AGE-RAGE信号通路（29/86）、卡波肉瘤相关性疱疹病毒感染通路（26/23）和细胞凋亡信号通路（23/86）。而在细胞凋亡信号通路中涉及23个基因，包括TRAIL、caspase-3和Bcl-2等基因。因此，本研究进一步通过大鼠体内实验验证RSV治疗MI/R损伤可能与细胞凋亡通路及这3个基因表达有关。

TRAIL是肿瘤坏死因子超家族成员之一，通过与其不同的受体结合，参与调控细胞增殖、凋亡和炎性反应等病理生理学过程[15-16]。有文献显示，在胰腺癌细胞系（SW1990、PaTu8988和BxPC3）中，过表达TRAIL能够上调TRAIL受体1和2的表达，促进肿瘤细胞凋亡[17]；在急性淋巴细胞白血病细胞株中，体外联合枸杞多糖和TRAIL能够激活caspase-3活性，增加肿瘤细胞对TRAIL诱导细胞凋亡的敏感性[18]。以上研究结果共同表明，TRAIL在细胞凋亡中发挥重要作用。但是有关TRAIL对MI/R损伤引起心肌细胞凋亡的作用尚未见报道。因此，笔者基于前期的网络药理学分析结果推测，RSV可能通过调控TRAIL表达，逆转MI/R损伤。因此，本课题组构建了MI/R损伤大鼠模型，探究RSV能否通过抑制TRAIL表达，降低心肌细胞凋亡，进而减轻心肌损伤。HE染色结果显示，与MI/R组大鼠相比，RSV组大鼠心肌纤维排列规则，心肌间隙变小。TUNEL染色结果显示，心肌细胞凋亡率显著降低。进一步通过蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白表达，结果发现与MI/R组相比，RSV组caspase-3表达水平显著降低，Bcl-2表达水平显著升高。为明确RSV能否通过调控TRAIL表达来抑制细胞凋亡，本研究采用免疫组织化学法和蛋白质印迹法检测TRAIL蛋白表达，结果显示：相比于Sham组，MI/R组TRAIL表达量显著增加，而RSV处理后TRAIL表达水平显著降低。以上结果表明，RSV能够通过调控TRAIL表达抑制MI/R心肌细胞凋亡。

综上所述，本研究通过网络药理学预测以及大鼠体内实验验证发现，RSV能够抑制TRAIL蛋白表达，降低心肌细胞凋亡，进而减轻MI/R损伤；这为今后应用RSV治疗MI/R损伤提供了新的理论基础。