褐藻降血糖活性物质的研究进展

袁鑫，闫培生

（哈尔滨工业大学（威海）海洋科学与技术学院，山东 威海 264209）

高血糖（hyperglycemia）是一种慢性疾病，发生在胰腺不再能够制造胰岛素或人体无法充分利用其产生的胰岛素时，会导致血液中葡萄糖水平升高。在中国已有1.14亿的患病人数，6 130万的未诊断人数以及4 680万的前期患者[1]。糖尿病患者糖基化产物的积累和伴随的结构性细胞外基质修饰导致了糖尿病功能性并发症的发展，包括心血管疾病、肾病、眼部疾病等，大大增加了其死亡率[2]。目前，有效的降血糖药物包括二甲双胍、格列美脲、阿卡波糖、诺和灵30R、优泌林70/30等，这些药物虽然有效，但长期使用依然会产生相应的继发症，如库欣综合征、肢端肥大症等[3]。因此开发天然、无副作用的新型药物迫在眉睫。随着我国海洋强国的提出，现在进入了大规模开发利用海洋时期，期望从海洋中找到新的降血糖药物，对海藻降血糖活性物质的研究由来已久，尤其是褐藻，由于其种类丰富、结构新颖已成为开发降血糖药物的重要来源。

1 褐藻降血糖活性物质的种类

褐藻是海洋藻类中较高级的多细胞生物，主要指海带、裙带菜、马尾藻、鹿角菜等，近年来，随着对褐藻有效成分的分离与鉴定，证明了其降血糖活性物质的多样性。

1.1 多糖类

褐藻多糖是一类分子量大、结构复杂、具有其它多糖不具有的药理活性的天然化合物，目前主要是从海带、墨角藻等中提取，以褐藻胶和褐藻糖胶形式存在[4]。徐宏亮通过对链脲佐菌素导致的糖尿病小鼠模型发现，每天喂食来自墨角藻的褐藻多糖500 mg/kg，发现其对糖尿病小鼠的血糖有显著抑制作用，在喂食第21天后，血糖含量降低了11.3%，在第32天，下降了21.1%，并发现其可能通过调节血糖代谢或抗氧化等方面，显著降低血糖含量，但其并未对褐藻多糖进行纯化鉴定，没有明确其有效成分[5]。王晶等通过对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠发现，褐藻多糖硫酸酯对糖尿病小鼠的体重和糖耐量没有显著影响，却可提高血清胰岛素水平，并通过摘除右肾后注射链脲佐菌素致患糖尿病小鼠模型研究发现，模型组小鼠的白内障患病几率低于空白组，且尿蛋白含量减少，在给药第8周、10周血糖明显下降，推测其可能是通过提高血清胰岛素水平，降低血糖含量[6]。徐颖婕通过对链脲佐菌素导致的糖尿病小鼠模型发现，低分子量褐藻多糖硫酸酯（8 177 Da），以低剂量 100 mg/kg、高剂量 200 mg/kg给模型小鼠灌胃，高剂量效果好于低剂量组，都可以减轻蛋白尿的发生，其糖化血清蛋白高剂量组第69天时的含量为（219.9±58.1）mmol/L，低于模型组小鼠的（279.2±41.6）mmol/L，可通过抑制乙酰肝素酶及相关生长因子的表达，来减轻肾病并降低血糖含量缓解糖尿病[7]。Heeba等通过喂食高脂饮食12周的小鼠模型，在第4周开始口服岩藻依聚糖（100 mg/kg），结果显示，其可减缓非酒精性脂肪肝的发展，降低空腹血糖含量及对胰岛素的抵抗，有效降低了血脂含量[8]。Kim等通过对岩藻依聚糖的结构研究发现，较低的硫酸盐含量（15.5%）和中等分子量（2 351 kDa）的岩藻依聚糖可以通过与α-淀粉酶静电结合而抑制其活性，从而发挥对2型糖尿病的治疗[9]。海藻酸钠主要是从马尾藻、海带等褐藻中提取到的，由β-D-甘露糖醛酸（M糖），和α-L-古洛糖醛酸（G糖）连接而成的钠盐，其具有降血糖、抗氧化等功能。Sim Sung-Yi等从裙带菜中提取褐藻多糖，将3T3-L1细胞（小鼠成纤维细胞）分别用10、50、100、200 μg/mL 处理，通过 AdipoRed分析脂肪细胞分化过程中的脂质积累，发现其活性呈剂量关系抑制3-磷酸甘油脱氢酶（glycerol 3-phosphate dehydrogenase，GDPH）的活性，改善胰岛素刺激的葡萄糖摄取和抑制脂肪细胞中的基础脂解，以达到抗糖尿病的功效[10]。

1.2 寡糖类

衍生自海藻细胞壁的寡糖具有多种生物活性，也已成为降血糖药物的重要来源。祝君梅等通过四氧嘧啶糖尿病模型小鼠的研究，利用从高等褐藻细胞壁中提取到的壳聚糖的降解产物壳寡糖以600、300、150 mg/kg喂食模型组小鼠21 d，发现其给药后的胰岛素水平均升高，分别为（39.41±17.2）、（31.14±7.91）、（30.46±11.03）mmol/L， 高于模型组的胰岛素水平（27.95±1.79）mmol/L，对正常小鼠的血糖含量无影响，可有效降低糖尿病小鼠的血糖水平，其作用机理为增强胰岛素受体的敏感性，以达到降血糖的作用[11]。张敖珍等通过四氧嘧啶糖尿病小鼠模型的研究，喂食硒化卡拉胶寡糖（硒含量1.125%）高、中、低3个剂量组的模型小鼠，其中中、小剂量组的血糖含量与正常小鼠的无显著变化，均在（5.78±1.85）mmol/L，而高剂量组的血糖含量明显降低，其值为（4.59±0.89）mmol/L，但其作用机理目前尚不明确[12]。

1.3 生物肽

多种氨基酸以不同排列方式组成肽，而肽又是组成大分子蛋白质的前提。蛋白质组学领域的发展为解决糖尿病等健康问题提供了有前途的解决方案。功能肽通常是在体内或体外条件下存在，使用不同种类的蛋白水解酶通过酶促水解从蛋白质中产生的，具有多种活性，包括抗糖尿病和免疫调节[13-14]。孟然研究发现海带酶解物（蛋白质含量为30.56%）对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶均具有抑制作用，其IC50值分别为8.24 mg/mL、16.76 mg/mL，且抑制作用与剂量浓度呈正相关[15]。糖尿病会引起机体抗氧化能力的下降，因此，提高抗氧化能力会从侧面有效的缓解糖尿病以提高机体氧化应激能力。黄钦钦等通过酶解条斑紫菜获得以1 000 Da以下二肽到五肽为主的小分子活性肽蛋白酶解液，并解析出两条多肽的氨基酸序列，分别为丙氨酸-脯氨酸（Ala-Pro）、脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸（Pro-Gly-Gly-Val），测出 1 000 Da以下粗肽液对α-葡萄糖苷酶的IC50为19.83 μg/mL，低于阿卡波糖的IC50值 35.65 μg/mL，具有明显的降血糖功能[16]。

1.4 膳食纤维

膳食纤维被定义为“凡是不能被人体内源酶消化吸收的可食用植物细胞、多糖、木质素以及相关物质的总和”，海藻中含有丰富的膳食纤维，马尾藻、江蓠等均是其来源[17]。汤宇青等将石莼脱蛋白处理后得到水溶性膳食纤维，测定其对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性均高于未脱蛋白前，其最大抑制率分别为43.90%、63.02%，并具有明显的量效关系[18]。李耀冬等通过对四氧嘧啶糖尿病小鼠模型灌胃高、中、低剂量组的复方海藻膳食纤维混悬液，并测量模型小鼠的空腹血糖含量，结果表明高、中、低剂量组的血糖含量均低于正常小鼠的血糖（21.52±2.55）mmol/mL，且存在明显的剂量关系，证实海藻膳食纤维可有效的降低模型小鼠的血糖水平并减轻胰岛β细胞受损程度[19]。Isabel等通过研究健康志愿者餐后血糖反应，先采集禁食状态下的血糖含量，再测量食用海苔15、30、45、60、90、120 min时的血样分析表明，摄入富含膳食纤维的海苔面包后，在30 min～60 min时发现了葡萄糖粒，葡萄糖水平持续到120 min，以此计算淀粉消化率做为预测血糖含量的指标，其作用机制可能是通过改变面包中淀粉的生物利用度，促进淀粉的消化以降低血糖水平[20]。Mojica等通过比较裙带菜、长卷心菜、紫菜的氯仿、乙醇和水溶液提取物对α-葡萄糖苷酶和葡萄糖扩散的体外抑制活性表明，可溶性膳食纤维对降血糖具有有效作用[21]。肖红波等通过给四氧嘧啶糖尿病小鼠喂食高、低剂量组的可溶性裙带菜膳食纤维，测定其血糖，发现其对正常小鼠的血糖含量无明显影响，其血糖含量均在（8.55±1.13）mmol/L，但对模型组小鼠的血糖含量有显著降低，高、低剂量组模型小鼠的糖异生率为7.8%、5.6%，作用机制可能为降低了四氧嘧啶对胰岛β细胞的损伤或改善了受损伤胰岛β细胞的功能，以达到降血糖的功效[22]。

1.5 酚类

海藻多酚是海藻次级代谢产物，随着提取和分离纯化技术的改进，人们对其生物活性有了更深的了解，其在降血糖新药开发的作用越来越重要。海藻多酚具有很强的自由基清除性能，因此具有较强的抗氧化能力。Spurr等发现水和乙醇-水的混合物是大规模从海藻中提取间苯二酚最适合的溶剂[23]。Seung-Hong Lee等从褐藻Ecklonia cava中提取到一种邻苯二酚的生物多酚化合物，以80名糖尿病前期的男性和女性成年人为研究对象，分为平行分组设计的随机、双盲和安慰剂对照试验，记录血糖参数、血清生化和血液学的影响，发现其可保护细胞免受高血糖引起的氧化应激所造成的伤害，也可对2型糖尿病患者的肝糖和脂质代谢具有有益作用[24]。Hyun-Ah Lee等从褐藻Ecklonia cava中分离到一种间苯三酚，以链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠为模型，喂食后在0、30、60、120 min从尾静脉采血，并通过血糖仪测量血糖，并以阿卡波糖为阳性对照，测定其对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性，发现其IC50分别为23.35、6.94 mg/mL，而且该酚还可延迟碳水化合物的消化和在小肠中的吸收，从而降低了餐后血糖水平[25]。

2 褐藻降血糖活性的检测方法

2.1 动物模型

在验证提取物降血糖功能时，通常使用四氧嘧啶和链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠模型。其原理是：四氧嘧啶是有毒的葡萄糖类似物，其优先通过葡萄糖转运蛋白积累在胰腺β细胞中，在细胞内硫醇（尤其是谷胱甘肽）存在的条件下，四氧嘧啶在循环氧化还原反应中会与其还原产物二乙酸产生活性氧，并与铁催化反应步骤中产生羟自由基，这些羟自由基导致β细胞的死亡，并最终导致胰岛素依赖性“四氧嘧啶糖尿病”。链脲佐菌素分为葡萄糖和甲基亚甲基脲部分，由于其烷基化特性，后者可以修饰生物大分子，使DNA断裂并破坏β细胞，从而导致胰岛素依赖状态[26]。而在高血糖小鼠模型的建立上也要注重模型的稳定性和成模率。朱之烽等通过正交试验，确定了在第3周开始注射链脲佐菌素（streptozotocin，STZ），注射剂量为85 mg/kg（注射2次，每次间隔5 d），成模率在90%以上，使其更接近2型糖尿病[27]。

2.2 分子模型

因为目前普遍的降血糖药物（阿卡波糖、格列宁）均是α-葡萄糖苷酶抑制剂，所以提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用是一个降血糖效果的指标。α-糖苷酶抑制剂不像胰岛素或磺酰脲类具有降血糖活性，相反，在摄入碳水化合物后降低健康和糖尿病个体的餐后血糖升高，减少餐后胰岛素分泌，其减少了极低密度脂蛋白的合成，并且与胰岛素和磺酰脲类药物相比，没有脂肪形成潜力[28]。其酶促反应体系如下：以阿卡波糖为阳性对照，等量的缓冲液为阴性对照，样品液先通过微孔膜过滤，将α-葡萄糖苷酶与各浓度梯度的样品溶液充分混合，然后经过保育，再加入适量的对硝基苯-α-D-葡萄糖苷（P-Nitrobenzene-α-D-glucoside，PNPG），最后再加入终止剂，在405 nm波长下测定吸光度（OD）值，其抑制率公式为：

抑制率/%=（1-样品组OD值/阴性对照组OD值）×100

同时蛋白酪氨酸磷酸酶1B（protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B）是开发治疗糖尿病药物的有效靶点之一，PTP1B是胰岛素信号通路的重要调节剂，其可使胰岛素受体激酶的络氨酸残基去磷酸化来负调控胰岛素信号的传导，因此PTP1B是治疗2型糖尿病的诱人靶标[29]。

3 褐藻降血糖活性物质的提取方法

3.1 多糖类的提取

褐藻多糖提取多以成本低且操作简单的稀酸、稀碱和水提法居多，随着近些年来微波、超声、酶解法的发展，人们对其提取工艺的研究越加深入。戴圣佳等通过单因素和正交试验优化了海藻多糖硫酸酯的超声提取工艺，确定了最佳提取条件：超声功率250 W、超声时间 25 min、料液比 1 ∶70（g/mL）、温度 60 ℃[30]。谭洁怡等进行了超声波法提取裙带菜中褐藻多糖硫酸酯的提取工艺优化，确定了最佳提取条件：固液比1∶100（g/mL）、超声功率 1 000 W、超声时间 25 min，该条件下的褐藻多糖硫酸酯的得率和纯度比水提法提高了23.59%、30.92%[31]。Rosa等进行了微波法提取岩藻依聚糖的提取工艺优化，确定了最佳提取条件：在压力 827.4 kPa、萃取时间 1 min、料液比 1 ∶25（g/mL）时，岩藻依聚糖的收率最高为18.22%[32]。Noelia等对超声法提取鼠尾藻中的岩藻依聚糖的工艺进行了优化，确定了最佳提取条件：温度25℃、超声功率150 W、频率40 kHz、时间5 min～30 min，在最佳条件下提取到的产物：质量比为 1∶0.70∶0.33∶0.27∶0.22∶0.10 的岩藻糖：半乳糖：葡萄糖：木糖：甘露糖：鼠李糖的寡糖，超声提取裙带菜可提高收率并减少提取时间，而且比标准岩藻依聚糖（767.2 kDa）和常规岩藻依聚糖（582.5 kDa）相比，平均相对分子质量降低了（390.6 kDa）[33]。Quitain 等进行了微波-水提法对裙带菜中提取褐藻糖胶的工艺研究，结果表明，与常规加热相比，微波加热更具优势，可以在接近140℃的温度下获得5 kDa～30 kDa的低分子量组分，在恒定的微波功率下，在短短的1min照射时间内连续进行微波照射，就可获得理想结果，并且在水热加热的微波照射过程中，由于分子搅拌，局部加热和传质的改善等热效应，褐藻糖胶的降解得到增强[34]。

3.2 褐藻寡糖的提取

传统的褐藻寡糖多是用浓酸水解海藻酸钠，但伴随着严重污染和聚合度难以控制等问题，随着酶解法、氧化降解法等的提出，大大解决了该问题。贺秋红等利用响应面法优化了海藻寡糖的提取工艺，最佳条件为：海藻酸钠质量浓度1 g/100 mL、酶解温度40℃、pH8.0，得到的寡糖的平均聚合度为4.08，比优化前降低了27.35%[35]。李海波等采用氧化降解技术从马尾藻等藻类中提取海藻胶低聚寡糖的工艺进行了优化，最佳条件为：氧化剂（H2O2）浓度6%、反应时间8 h，其产率达到最高60%左右[36]。Hyun-Jee Kim等从褐藻Sargassum Thunbergii中提取了一种可降解藻酸盐的细菌，通过16 S rRNA序列分析其为弧菌属菌株，可在pH为7、3% NaCl和6%海藻酸、孵育48 h，经过薄层色谱分析结果表明，其可用于藻酸盐寡糖的制备[37]。

3.3 膳食纤维的提取

褐藻中含有大量的半纤维素和纤维素，是膳食纤维的重要来源。费亚芬等从7种海藻中筛选出龙须菜的膳食纤维含量最丰富，其含量为67.17%，并用响应面优化了残渣膳食纤维的提取工艺，最佳条件为：料液比 1∶95（g/mL）、时间 50 min、温度 50℃、功率 200 W，此条件的实际得率为8.23%[38]。吕钟钟通过单因素试验，确定了木瓜蛋白酶酶解蛋白质的最佳工艺，其条件为：pH6.5、温度50℃、酶量0.5%、酶解时间2 h[39]。李来好等通过酶-化学相结合的方法优化了海带膳食纤维的提取工艺，其最佳条件为：纤维素酶含量100U/g、蛋白酶2 000 U/g、时间1 h，其产率可达到27.1%[40]。

3.4 多酚类的提取

国内外有关多酚的提取方法主要有：水和有机溶剂提取法、离子沉淀法、超声波浸提法、低温纯化酶法、超临界萃取等方法[41]。从海藻中分离得到的多酚主要为褐藻多酚类、黄酮类、酚酸类和卤代酚类等。娄燕通过单因素试验和响应面法优化了从鼠尾藻中提取多酚的工艺，其最佳条件为：料液比为1∶25（g/mL）、乙醇浓度为40.2%、浸提时间40 min，其鼠尾藻多酚的理论浸出率为1.704%，实测为1.703%[42]。Minseok Yoon等通过响应面法优化了从褐藻Ecklonia cava中回收芦丁单宁的提取条件，其最佳条件为：乙醇浓度为95%、提取温度80℃、提取时间24 h，在此条件下，提取出的总芦丁单宁为57.2 mg，间苯三酚的收率为7.8%[43]。Michalak等从浒苔中提取多酚，确定了最适实验条件为：时间8 h和100 μL纤维素酶的水解产率为36%，每100g干提取物的总酚含量为55mg没食子酸当量[44]。K.H.Sabeena等用体外抗氧化剂测定法筛选了16种来自丹麦海岸的海藻的水和乙醇提取物的抗氧化活性，发现乙醇比水更有效的萃取多酚，通常，各种抗氧化测定与总酚含量相关性很好，说明藻类多酚是这些提取物的活性成分。但是，在某些抗氧化剂测定中，总酚含量较低的某些物种也显示出良好的抗氧化功能，表明乙醇提取物中的其他成分如硫酸化多糖、蛋白质等也具有抗氧化活性[45]。

4 展望

糖尿病已经成为人类健康的一大杀手，而目前的降血糖药物大多数是化学合成的，虽能有效的抑制高血糖，但随着用药的增加和身体状况的变化，都会产生许多副作用，因此，海洋药物是人类的一个重要选择。海藻尤其是褐藻具有多种降血糖活性物质，然而目前对其缺乏有效的提取手段，且大多数均利用化学方法提取，这无疑增加了提取成本。褐藻降血糖活性物质的结构鉴定、构效关系与作用机制也尚不明确。随着组学的发展，将此利用在降血糖海洋药物的开发上显得势在必行。