RNA m6A甲基化参与肾脏纤维化进展的实验研究

陈静 张函 顾玉露 丁小强 章晓燕

200032 上海，复旦大学附属中山医院肾内科

慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)是一种严重危害人类健康的慢性疾病。RNA甲基化主要发生在N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，m6A)位点[1]。m6A修饰在基因表达调控、mRNA剪接、RNA稳定性等方面扮演重要角色[2]。m6A修饰主要由甲基化酶(writers)、去甲基化酶(erasers)和识别蛋白(readers)所调控，参与RNA剪接、出入核、蛋白质翻译及降解等多种生物学过程[3-5]。甲基化RNA免疫共沉淀结合高通量测序(Methylated RNA Immunoprecipitation with next generation sequencing，MeRIP-seq)[5]，使用N6-甲基腺嘌呤抗体富集高甲基化的RNA片段，并通过结合高通量测序，能够高效精确的在全转录组范围内检测发生甲基化的RNA区域。通过使用这一技术，我们可以比较不同细胞、组织、样本间的RNA甲基化修饰模式的差异，发现疾病发生、发展过程中的关键生物学改变[6-7]。

近年研究表明，m6A在肿瘤发生、发展中发挥重要作用[1]。但在肾脏纤维化发生过程中m6A变化如何、扮演什么角色？目前还不明确。本研究基于MeRIP-seq数据库解析肾脏纤维化发生过程中RNA m6A的变化，筛选出差异基因和关键通路，初步确定参与调控RNA m6A的关键甲基酶，为肾脏纤维化的RNA甲基化机制研究提供重要理论参考。

材料与方法

一、实验动物与试剂

1.动物 健康的6～8周龄雄性小鼠(种系C57BL/6)，重量19～24 g，购自上海杰思捷生物科技有限公司，自由进食饮水。

2.试剂 PrimeScript RT试剂盒(日本Takara公司)、RNAiso Plus(Trizol)(美国Thermo公司)、SYBR Green PCR试剂盒(日本Takara公司)

二、方法

1.动物模型与实验分组 C57BL/6小鼠适应环境7 d。采用随机数字表法分成2组：假手术组(Sham组)(n=6)、肾脏纤维化组(UUO组)(n=6)。UUO组经小鼠背部右侧切口将小鼠右侧输尿管游离、结扎并剪断，Sham组仅游离右侧输尿管不结扎。造模7 d后收集肾组织标本。

2.mRNA样品制备 利用Trizol法提取总RNA并检测RNA的浓度和纯度。使用rRNA试剂盒去除rRNA，琼脂糖凝胶电泳法检测RNA完整性。然后高频超声仪随机打断RNA样本，将片段化的RNA与m6A抗体加入IPP缓冲液中，4 ℃孵育2 h。进一步反应混合物用protein A磁珠在4 ℃环境下免疫沉淀2 h。之后用游离的m6A腺苷类似物洗脱磁珠上结合的mRNA。洗脱的mRNA进一步通过Trizol试剂(Thermo Fisher)进行抽提。抽提纯化的RNA进行质谱检测，并进一步MeRIP-seq测序(上海云序生物公司)。

3.RT-PCR检测 根据已有文献报道，选取目前已知m6A关键调控酶甲基转移酶样蛋白(methyltransferase-like protein,METTL)3、METTL4、METTL14、肥胖相关基因(fat mess and obesity us sociated,FTO)、ALKBH5基因进行RT-PCR检测。所用引物均由上海生工生物技术有限责任公司合成，具体引物序列见表1，其中18s作为内参对照，采用2-ΔΔct分析方法计算目的基因的表达差异。

表1 RT-PCR引物列表

4.免疫组化检测 使用Abcam公司的METTL14抗体(货号：ab252562，抗体使用浓度1∶200)，检测小鼠肾脏组织METTL14的表达情况。

三、统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件，所有RT-PCR结果数据以Mean±SD表示，进行单因素方差分析。采用Dunnet’s T3法分析组间差异，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、质谱结果

首先通过MASSON染色，证实肾脏纤维化模型造模成功(P<0.05)。我们使用质谱法检测两组RNA m6A含量变化(由复旦大学生物医学研究院提供技术支持)，发现UUO组肾脏RNA m6A含量显著升高(P<0.05)。(图1)

二、测序结果

我们使用Ilumina平台对Sham组和UUO组肾组织样本RNA m6A进行比较发现，与对照组相比，UUO处理肾脏差异表达1.5倍以上的差异甲基化的编码基因共1 352个，其中上调906个，下调446个，包括细胞连接、炎症反应、转分化、钙离子结合、细胞黏附等相关的基因。(图2～3)

三、m6A关键调控酶的筛选

采用RT-PCR检测METTL3、METTL4、METTL14、肥胖相关基因(fat mass and obesity associated，FTO)、ALKBH5基因的表达差异情况。进一步通过免疫组化方法，我们发现METTL14在肾脏的主要表达部位为肾小管上皮细胞的细胞核，UUO组肾脏METTL14表达显著升高(P<0.05)。由此，我们推测RNA m6A甲基转移酶METTL14可能是肾脏纤维化过程中m6A的关键调控酶。(图4)

讨 论

本研究通过高通量测序的方法，研究了RNA m6A修饰在UUO小鼠纤维化肾脏的变化发现，纤维化肾脏m6A含量显著升高。我们还初步筛选了引起m6A变化的调控酶，发现METTL14在UUO组显著升高，可能是引起m6A参与肾脏纤维化的关键调控酶。

m6A甲基化修饰是一种动态可逆的反应，由甲基化酶、去甲基化酶和甲基化阅读蛋白共同参与[8-10]。RNA m6A修饰主要由甲基转移酶系催化进行，以METTL3和METTL14最为重要。甲基转移酶的主要作用就是催化mRNA上腺苷酸发生m6A修饰。而去甲基化酶包括FTO和ALKBH5等，它的作用是对已发生m6A修饰的碱基进行去甲基化修饰，使RNA甲基化成为一种可逆的反应[8-9]。研究还发现m6A甲基转移酶(如METT14)和去甲基酶(如FTO)分别作为编码器和消码器。m6A的阅读器可以选择性地结合到含有m6A修饰位点的RNA上，从而介导下游基因表达调控效应。国内外越来越多的学者在胚胎干细胞的维持和分化、昼夜节律改变、热休克反应、减数分裂进展和神经元功能等方面开展了m6A的深入研究[10]。然而，目前仍有大部分RNA修饰的生物学作用未被发现，尤其是m6A甲基化在肾脏纤维化发生和发展中的作用。

本研究通过高通量测序的方法，分析了RNA m6A修饰在UUO小鼠纤维化肾脏RNA m6A甲基化差异位点的变化。这些差异化位点基因包括细胞连接、炎症反应、转分化、钙离子结合、细胞黏附、血管钙化等，其中差异最显著的基因Cyclin D1在调控细胞周期中发挥重要作用，为本课题后续的分子机制研究提供了重要依据。在本研究中，我们还通过RT-PCR实验初步筛选了参与调控RNA甲基化的关键调控酶，发现METTL14可能是引起肾脏纤维化过程中一系列基因表达改变的关键酶。由此我们推断METTL14可能是RNA甲基化参与肾脏纤维化的关键调控酶。结合目前RNA甲基化的系列研究，我们将围绕甲基化酶METTL14在肾脏纤维化中的作用开展深入研究。本研究的不足之处，我们只观察了输尿管梗阻后7 d的肾组织RNA m6A表达变化，对于梗阻后RNA m6A的动态变化过程没有进行观察，所以不能对其与肾脏纤维化发生、发展的相关性做出有效的预测。

RNA表观遗传学已成为表观遗传学中一个快速发展的研究热点，在未来人类疾病的治疗方面有很好的发展前景[11-15]。因此，深入研究和探讨RNA甲基化在肾脏纤维化的生物学作用，将加深我们对肾脏纤维化病理机制的理解，为临床诊断和治疗提供新思路。