全可吸收人工韧带的制备与功能性评价

黄云帆，林 婧，谢晓静，卢 俊，劳继红，王 璐

(东华大学 a. 纺织学院；b. 纺织面料技术教育部重点实验室，上海 201620)

前交叉韧带(anterior cruciate ligament，ACL)是膝关节内重要的韧带结构，其主要功能是防止股骨后移或胫骨过度前移，维持膝关节稳定并协助控制膝关节旋转和侧方运动[1]。据报道[2-3]，美国每年有20万例前交叉韧带损伤病例，且由于关节内滑膜液的存在以及ACL本身的低血管化，其损伤时无法形成血凝块，因而难以发生内源性愈合，需要手术介入治疗。目前，临床使用最广泛的治疗方法为自体移植、同种异体移植以及人工韧带重建。然而，自体移植受供体部位并发症与来源的限制，同种异体移植面临免疫排斥、疾病传播的风险[1-2, 4-6]。而人工韧带的临床应用更为广泛，且其需求日益增加。

人工韧带在20世纪七八十年代开始出现并逐步兴起[6]，其第一代产品包括原材料为聚四氟乙烯的Gore-Tex韧带，原材料为聚丙烯的Polyflex韧带，以及以碳纤维为基材的Proplast韧带，但这些产品因植入人体后出现关节腔周围组织发育不良、并发症高等问题而逐步退出市场。随后Dacron、Pro-Flex和Kennedy等人工韧带面世，其短期疗效较佳，但中远期组织无法向内生长且滑膜异物反应严重[7]。目前，临床受用最广泛的人工韧带是法国的LARS人工韧带，其强度较高，并且其经编结构赋予韧带织物以一定的孔隙率，可促进细胞的生长[8]，短中期修复效果良好，但长期随访结果表明，LARS人工韧带所使用的不可吸收聚酯材料长期存在于膝关节内，材料与骨界面、材料与材料之间磨损产生的碎屑将引发关节炎等疾病，并且LARS人工韧带在服役期持续的高强度对新生组织存在应力遮挡效应，而且无法诱导再生形成完整的自体韧带[9-11]。

本文拟制备一种可吸收人工韧带，通过探究可吸收材料不同组分配比以及人工韧带编织结构对其力学性能与降解性能的影响，研发一种高强度、多组分、核壳结构的可吸收人工韧带，使其在植入初期具有较高的强度，并且随着材料的逐步降解以及新生组织的长入，使自体韧带承受适当强度的负荷但无断裂风险，以确保服役期移植物的力学性能。

1 材料与方法

1.1 纤维材料的选择

文献[12-13]指出：前交叉韧带重建术后6周内，移植物将经历无血管化坏死和新生血管形成两个阶段，可观察到少量无序胶原纤维；6～24周，新生韧带重塑，基本恢复其原有功能。由此可见，人工韧带需要在6周内保持优良的力学性能，6～24周，为组织长入提供空间同时维持一定的力学强度。故本文选用3种可吸收材料，即PPDO(polydioxanone)、PGCL(poliglecaprone)和PGLA(polyglactin)(苏州迈缇康医疗科技有限公司)。纱线规格及其力学性能如表1所示，每根PGLA复丝由300根直径为5 μm的单丝组成。其中，纱线拉伸性能参照GB/T 3916—2013进行测试，纱线直径采用SMZ745T型立体显微镜(上海尼康仪器有限公司)测试。

表1 纱线规格及其力学性能

1.2 高强度、多组分、核壳结构全可吸收人工韧带的结构设计与制备

根据PPDO、PGCL与PGLA纱线的力学性能以及其在体内完全吸收的时间(分别为180、90～120和56～70 d[14-15])，设计了2种组分配比，即PPDO、PGCL和PGLA纱线的根数分别为6∶4∶2和4∶6∶2，对应的配比编号依次为A和B。由于中空结构不利于细胞贴附增殖，无法为组织生长提供载体[16]，影响韧带修复速度与质量，故本文设计了一种核壳管状结构，其壳层为单层(Ⅰ)或双层(Ⅱ)，核层由不同股数的PPDO、PGCL和PGLA编织纱组成。核层与壳层编织结构中，纱线呈轴向螺旋型上升排列，更适用于模拟人体ACL[17]，且可以为细胞的长入提供空间，有利于物质交换和细胞增殖。试样组分配比与核壳结构设计参数如表2所示，核壳管状人工韧带结构示意图如图1所示。

表2 试样组分配比与核壳结构设计参数

在东华大学自主设计研发的一体成型编织机上进行核层编织纱的织造成型，再将其作为内芯引入壳层进行一体化管状织物编织成型。在DHG-9055A型电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器股份有限公司)中进行热定型，定型温度为80 ℃，时间为40 min，制得直径为3.5 mm的管状试样。

1.3 结构参数测试

采用SMZ745T型立体显微镜观察人工韧带的结构特征，包括人工韧带中纱线的分布。根据显微镜照片，使用MB-Ruler软件测得人工韧带的直径、相邻同种纱线间的距离(节距)以及编织角。

1.4 力学性能测试

前交叉韧带重建术后早期，韧带断裂是其面临的主要风险。而在康复阶段的中后期，人工韧带需在突然且快速的生理活动后恢复原长[18]，且具有一定的抗疲劳强度[19]。采用YG(B) 026G-500型医用纺织品多功能强力仪(温州大荣纺织仪器有限公司)测试人工韧带的拉伸性能、弹性回复性能以及循环拉伸疲劳性能。每项测试中，试样样本数均为5，取平均值并计算标准偏差。

1.4.1 拉伸性能

将试样以24 mm/min(2%/s)的速率拉伸直至断裂，拉伸初始隔距为20 mm[20-21]。试样断裂强度的计算方法如式(1)所示。选取试样应力-应变曲线线性部分计算弹性模量[22]，如式(2)所示。

(1)

式中：σ为断裂强度，MPa；F为断裂强力，N；S为试样横截面积，mm2。

(2)

式中：E为弹性模量，MPa；ε为应变。

1.4.2 弹性回复性能

一定次数的循环拉伸预处理可以提高试样的模量，减小残余形变，使应力-应变曲线稳定[18]。因此，所有试样在进行弹性回复测试前均进行预处理，初始隔距为20 mm，预处理载荷为30 N，拉伸速度为120 mm/min，循环次数为10次。预处理后，进行极限载荷下的单次弹性回复测试，极限载荷为46.8 MPa(接近但略小于人体ACL断裂强度)，加载与卸载速度均为120 mm/min，停留时间为1 s[18]。单次加载-卸载循环曲线如图2所示。

试样弹性回复率按式(3)计算。

(3)

式中：L为总伸长，mm；L′为残余伸长，mm。

1.4.3 循环拉伸疲劳性能

循环拉伸疲劳性能测试的定伸长率为10%，拉伸速度与回程速度均为120 mm/min，反复次数为500次，循环拉伸后，将试样再以24 mm/min的恒定速率拉伸直至断裂[22]。试样断裂强度衰减率(Δσ)和弹性模量增加率(ΔE)的计算如式(4)和(5)所示。

(4)

式中：σ为循环拉伸前断裂强度，MPa；σ′为循环拉伸后断裂强度，MPa。

(5)

式中：E0为循环拉伸前弹性模量，MPa；E1为循环

拉伸后弹性模量，MPa。

1.5 体外加速降解试验

人工韧带的再生诱导性能对于植入效果起着至关重要的作用，除了生物相容性涂层和生长因子，孔隙也是组织长入的关键因素之一[20]。目前关于可吸收人工韧带的研究都采用单一材料，未涉及梯度化降解，且未达到较大的初始强度，结构偏紧密且孔隙较少[23]，故在新生组织长入过程中无法提供足够的空间。

为快速观测人工韧带的降解过程，将试样浸没在pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，在恒温摇床中保持50 ℃、60 r/min的降解条件，每2 d换液一次，取样时间分别为0、3、6、9、12、18、24、30和36 d，试样取出后用去离子水清洗，用滤纸擦干表面水分，于-20 ℃冰箱中冷冻24 h后再冷冻干燥24 h。

1.6 细胞毒性试验

将试样充分剪碎并混匀，放入酒精缸过夜灭菌，按照0.1 mg/mL的标准[24]加入含血清的完全培养基(90% DMEM+10%胎牛血清+1%双抗+1%丙酮酸钠)，在37 ℃、CO2浓度为5%的培养箱中浸提24 h。以每孔105个细胞密度接种在96孔板上，再加入100 μL待测液体(试验组：100%浸提液；阴性对照组：完全培养基；阳性对照组：10%DMSO溶液)。培养1、3和5 d后取出，使用酶联测试仪(美国Thermo公司)测试各孔的吸光度(OD)值，选择波长450 nm。通过式(5)计算得出细胞的相对增殖率(Rgr)。根据表3中的分级标准评价细胞毒性[25]。

(5)

式中：ODm和ODn分别为试验组和阳性对照组的平均OD值。

表3 细胞毒性评级标准

1.7 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行数据的统计分析，用t检验法比较样本间的显著性差异，置信区间为[0,0.95]。不同试样间断裂强度、弹性模量以及循环拉伸前后试样的断裂强度和弹性模量进行显著性分析。

2 结果与讨论

2.1 人工韧带的结构参数

人工韧带的结构特征如图3所示，其中，蓝色纱线为PPDO，金色透明纱线为PGCL，白色复丝为PGLA。由图3可以看出，在壳层与核层结构中，3种纱线沿轴向螺旋上升排列，彼此交织。6种人工韧带试样的结构参数如表4所示。

表4 试样的结构参数

2.2 人工韧带的力学性能

2.2.1 拉伸性能

试样的拉伸断裂测试结果如图4所示。由图4可知，6种试样的断裂强度均大于人自体ACL的断裂强度(48.24 MPa)，试样Ab和Bb的弹性模量高于人自体ACL的弹性模量(111 MPa)[17, 26]。

当3种纱线组分配比相同时，3类不同编织结构人工韧带的断裂强度与弹性模量间的关系分别为Ab>Aa>Ac，Bb>Ba>Bc(P<0.05)，即编织结构b的断裂强度与弹性模量最高，c最低。虽然3种编织结构中PPDO、PGCL和PGLA纱线的总根数相同，但由于核层编织纱的编织角显著小于壳层编织结构(P<0.05)，因此，核层为主要承力结构，而壳层起包覆作用。结构b核层的6根6股编织纱间的排列比结构a核层的3根12股编织纱更紧密，抱合力更大；结构b核层编织纱的编织角(Ab和Bb试样分别为20.60°和24.91°)比结构a核层的编织角(Aa和Ba试样分别为29.29°和29.82°)小。由此可见，核层编织纱的结构以及纱线根数的差异导致不同试样的力学性能出现差异。因此，当试样受到轴向拉伸时，有更多的纱线承担轴向拉伸载荷，提高了试样的强度与模量。具有结构c的试样断裂强度与弹性模量显著低于结构a和b(P<0.05)。这是由于结构c的核层为2根12股编织纱，其能够承担轴向拉力的纱线根数仅为结构a和b的2/3，这种结构的人工韧带试样植入人体后将极易断裂或失效。因此，本文优选试样Aa、Ab、Ba和Bb做进一步分析全可吸收人工韧带的弹性回复性能和疲劳性能。

2.2.2 弹性回复性能

试样的弹性回复率测试结果如表5所示，加载-卸载单次循环曲线如图5所示。由表5可知，各试样的弹性回复率无显著性差异(P>0.05)。文献[18, 27]研究表明，编织人工韧带在接近人体ACL断裂强度(48.24 MPa)时的弹性回复率为30%～50%。本文所设计的试样(Aa、Ab、Ba和Bb)在接近人体ACL断裂强度时的弹性回复率均高于上述文献所述的结果，表明本文所设计的人工韧带具有着优异的回缩变形能力，能够在人体经历生理活动后快速恢复其原长，从而维持股骨和胫骨的相对位置。

表5 试样的弹性回复率

2.2.3 循环拉伸疲劳性能

人工韧带植入人体后须能够承受循环载荷，并允许膝关节在一定范围内运动而不受损伤[22]。在经过500次循环拉伸后，试样的拉伸断裂测试结果如图6所示。

由图6可知：循环拉伸后，所有试样的断裂强度仍显著大于人自体ACL断裂强度。试样Aa、Ab、Ba和Bb的断裂强度分别降低了10.21%、7.81%、5.33%和4.15%，试样Ba和Bb的断裂强度较循环拉伸前无显著性下降(P>0.05)。这是因为，与组分配比为A(PPDO∶PGCL∶PGLA=6∶4∶2)的试样相比，组分配比为B(PPDO∶PGCL∶PGLA=4∶6∶2)的试样中PGCL纱线根数多，而PGCL纱线的断裂强度大于PPDO纱线，因此循环拉伸对试样Ba和Bb的拉伸性能影响较小，使得这两种试样的强度衰减率较低。所有试样在循环拉伸后，弹性模量均有所增加。在拉伸过程中，编织结构中的纱线在循环载荷的作用下，发生移动与重排，更多的纱线趋于轴向排列，编织角减小，因此试样的弹性模量增大[27]。

2.3 体外降解性能

选取断裂强度与弹性模量最高的试样Ab、Bb进行体外加速降解试验。不同降解周期时的人工韧带试样的表观形态如图7所示。

由图7可以看出：降解前，人工韧带试样的3种纱线紧密交织；降解12 d后，试样Ab和Bb中PGLA纱线发生断裂，PGCL纱线表面出现纵向裂纹；降解36 d后，人工韧带中的PGLA与PGCL纱线已完全降解脱落，剩下降解周期较长的PPDO组分维持人工韧带的骨架。在降解前期，3种纱线共同支撑人工韧带的稳定结构，随着PGLA与PGCL纱线的降解，人工韧带出现更多的孔隙，PPDO纱线螺旋缠绕组成其基本框架，提供力学性能，同时为后续原位植入后组织的长入提供足够的空间。

体外加速降解试验于50 ℃下进行，升温加速降解过程中，聚合物材料未发生相变，即材料降解机制不变。文献[28]指出，50 ℃下材料的降解速率约为人体内环境温度(37 ℃)下降解速率的4.67倍。即试样在体外50 ℃环境下降解12和36 d分别相当于在体内降解8和24周，此时人工韧带的纤维与纤维间的空隙逐渐增大，允许新生组织沿剩余纤维爬行生长，形成自体韧带。由此可见，人工韧带的梯度化降解周期与前交叉韧带修复术后细胞增殖和组织长入的时间基本匹配，与韧带愈合周期基本吻合，即基本满足临床对于人工韧带可控梯度化降解的需求。

2.4 细胞毒性

试样细胞相对增殖率测试结果如图8所示。由图8可知，细胞在试样Ab和Bb浸提液中培养5 d后的相对增殖率分别为101.65%和96.74%。相比第1 d，试样Ab和Bb第5 d的细胞相对增殖率分别下降2.89%和1.15%，两种试样的细胞相对增殖率无显著性下降(P>0.05)。试样Ab和Bb的细胞毒性评级分别为0和1[25]，无细胞毒性，表明由本文所选用的3种可吸收材料制备的不同结构的人工韧带均具有良好的细胞相容性。

3 结 语

本文设计并制备了6种核壳结构的全可吸收人工韧带，研究了组分配比和编织结构(核层和壳层)对人工韧带力学性能、降解性能以及细胞相容性的影响。结果表明，试样Ab(组分配比PPDO∶PGCL∶PGLA=6∶4∶2，编织结构为6×6+Ⅰ)与Bb(组分配比PPDO∶PGCL∶PGLA=4∶6∶2，编织结构为6×6+Ⅰ)的拉伸性能和弹性回复性能更为优异，循环拉伸后仍满足人工韧带的力学要求，且具有较好的抗疲劳强度。体外加速降解试验结果表明，本文所设计的人工韧带试样的降解时间与组织长入时间基本匹配，符合人工韧带的临床功能性要求，且所有试样均无细胞毒性。后续有待于进一步开展动物试验以研究全可吸收人工韧带的原位降解性能与组织再生匹配性。