水中产气荚膜梭状芽孢杆菌的检测

余沛芝，刘玉红，章文华，何 敏，许小燕，徐小燕，周 婷

(苏州工业园区清源华衍水务有限公司水质中心，江苏苏州 215021)

产气荚膜梭状芽孢杆菌，属于芽孢杆菌科梭状芽孢菌属，在自然界中广泛分布，其芽孢是一种能够引起人类食物中毒和动物坏死性肠炎的食源性病原[1-3]。微生物污染是饮用水安全的一大威胁。因此，监测水中产气荚膜梭状芽孢杆菌，对评价水资源污染状况和评估自来水厂的水处理能力，均具有重要意义。

在《生活饮用水卫生标准》(GB 5749—2006)附录A[4]中，产气荚膜梭状芽孢杆菌为水质参考指标，且限值为0 CFU/(100 mL)，但未指定相应的检测方法。因此，对目前现行有效的3个检测标准(GB 4789.13—2012、GB/T 8538—2016和SN/T 0177—2011)[5-7]进行汇总对比。

参考这几个标准中所用到的分离培养基(胰胨-亚硫酸铵-环丝氨酸琼脂培养基，TSC)和增菌培养基(液体硫乙醇酸盐培养基，FTG)，借鉴文献中[8]提及的复苏培养基(疱肉培养基)，对购买的产气荚膜梭菌菌种同时进行复苏培养，考察该菌在这几种不同培养基中的生长情况。通过对不同培养基复苏后的同代培养产物，开展不同的性能确证试验，进一步验证其性能复苏状况，并记录下各自阳性反应的特征图片，作为样品检测的阳性对照。

传统检测方法存在检测步骤多、所需培养基种类多、检测耗时长、假阳性检出率高等缺点。因此，使用显色培养基，对南方某自来水公司双水厂的出厂水、水源水和某污水处理厂的进水、二沉池出水中的产气荚膜梭菌含量分别进行检测，发现与使用传统检测方法的结果一致，但使用显色培养基可明显简化检测流程和缩短检测时间。

1 材料和方法

1.1 试验设备和耗材

生物安全柜(苏净安泰)；恒温培养箱(上海精宏)；厌氧培养罐(日本三菱)；移液枪(BRAND)；生物显微镜(上海光学)；高压蒸汽灭菌器(雅马拓)；3联抽滤装置(默克)；0.45 μm微生物滤膜(密理博)；纯水机(密理博)；一次性接种环(RENON LAB INOCULATION LOOP)、一次性无菌吸管(FOOBON TUBES)、一次性无菌培养皿(NEST)。

1.2 菌种、培养基和试剂

产气荚膜梭状芽孢杆菌(CICC22949)来自中国工业微生物菌种保藏管理中心；疱肉培养基、疱肉牛肉粒、无菌液体石蜡、胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基(TSC培养基)及配套P-15B D-环丝氨酸、乳糖亚硫酸盐培养基、液体硫乙醇酸盐培养基(FTG培养基)、含铁牛乳培养基、乳糖-明胶培养基、革兰氏染色液，均来自北京路桥技术有限责任公司；还原铁粉(福晨化学)；缓冲动力-硝酸盐培养基(海博生物)；法国科玛嘉显色培养基(上海欣中)；磷酸盐缓冲溶液无菌稀释水(HARDY DIAGNOSTICS)；甲、乙试剂(广东环凯)；厌氧产气袋、厌氧指示剂(日本三菱)。

1.3 菌种复苏和性能验证

将购买的菌种冻干粉，用500 μL市售磷酸盐缓冲溶液无菌稀释水充分溶解后，用一次性接种环分别接种至疱肉培养基、FTG液体培养基，划线至TSC培养基平皿(划线后，需再覆盖1层TSC琼脂[8])，置于厌氧培养罐中，36 ℃培养24 h。取培养好的菌液，再接种至新的疱肉培养基、FTG液体培养基和划线至TSC培养基平皿，于36 ℃厌氧培养24 h。重复该步骤，得到第三代培养物。

参考文献[9]中指出，菌种复苏传代的第二、三、四代培养物均可开展相应的纯度和生化鉴定，本文选用不同培养基复苏后的第三代培养物，开展不同的性能确证试验。包括：(1)革兰氏染色，观察显微镜下的菌落形态；(2)取1 mL培养物接种于含铁牛乳培养基，以厌氧和有氧2种方式，置于46 ℃培养箱中培养5 h；(3)用接种针沾取培养物，接种至硝酸盐培养基，置于36 ℃培养箱中厌氧培养24 h；(4)用接种针沾取培养物，接种至乳糖-明胶培养基，置于36 ℃培养箱中厌氧培养24 h后，再将其置于4 ℃冰箱中冷藏1 h；(5)用无菌滴管取5滴培养物，接种至乳糖-亚硫酸盐(LS)液体培养基，置于46 ℃培养箱中厌氧培养24 h。

1.4 样品的检测

取南方某水司双水厂的出厂水和水源水各100 mL，用抽滤装置抽滤后，将滤膜紧贴置于TSC琼脂和显色培养基上，并用TSC琼脂和显色培养基对滤膜再次进行浇筑，形成厌氧环境。取南方某污水处理厂进水和二沉池出水各1 mL(进水稀释1 000倍)，分别用TSC琼脂和显色培养基进行浇筑，待凝固后，再分别覆盖TSC琼脂和显色培养基。对TSC琼脂中出现的黑色特征菌落，选取5个(不足5个时，全部选取)分别接种于FTG培养基中，厌氧培养24 h后，取每根FTG中的培养物5滴再次接种于LS培养基中，有氧培养24 h后，观察是否有黑色沉淀及导管中是否有大于1/4的气体，有则说明是阳性，否则为阴性。

2 结果和讨论

2.1 3种现行有效标准汇总对比

从检测范围、取样方式、初培养方式、分离培养基、增菌培养基、性能确证试验种类、结果汇总等方面，对现行有效的3个标准进行汇总对比，如表1所示。

表1 3个现行有效标准的汇总对比Tab.1 Summary and Comparison of Three Existing Effective Standards

由表1可知，这3个标准均采用传统的培养-增菌-性能验证-结果计数的检测模式：均需对待检样品初培养后的黑色特征菌落进行增菌培养；再对增菌后的菌液开展不同的性能验证试验，或使用全自动微生物鉴定系统进行性能确证；最后根据初培养的特征菌落数，结合性能验证试验结果，给出最终的检测结果。

2.2 菌种复苏和性能验证

2.2.1 菌种复苏

在目前现行有效的3个标准中，分离培养基有亚硫酸铵-环丝氨酸琼脂培养基和亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂培养基。文献[10]指出，在检测产气荚膜梭菌时，这2种培养基通过试验对比，发现TSC琼脂检测结果的标准差最小，数据最为稳定。同时，3种不同的标准均在检出特征菌落后，使用FTG培养基对特征菌落进行增菌培养，也有文献[8]使用疱肉培养基对产气荚膜梭菌的菌种冻干粉进行复苏培养。因此，选用TSC琼脂、FTG培养基和疱肉培养基，分别对冻干粉菌种进行复苏培养，考察菌种在这3种不同培养基中的生长情况。结果如表2和图1所示，产气荚膜梭菌的菌种在这3种培养基中，均生长良好。

表2 产气荚膜梭菌在不同培养基中的生长情况Tab.2 Growth of Clostridium perfringens in Different Media

图1 TSC培养基、FTG培养基、疱肉培养基培养物图片Fig.1 Cultures Resuscitated from TSC Medium, FTG Medium and Cooked Meat Medium

2.2.2 传代产物的性能验证试验

选用不同培养基的同代培养物开展性能确证试验，进一步考察不同培养基的性能复苏情况，同时也可作为样品检测的阳性对照。

其中：(1)革兰氏染色试验，结果均显示为革兰氏阳性杆粗短杆状菌，有明显荚膜，有的可见芽孢，呈卵圆形，位于菌体末端；(2)牛奶发酵试验，在5 h内均出现剧烈发酵现象，且培养基不变黑；(3)动力-硝酸盐确证试验，接种培养物在培养基中均无穿刺生长现象，往其中分别滴加甲、乙试剂后，均瞬间变为明显的深红色液体；(4)乳糖明胶确证试验，厌氧培养24 h后培养基均变黄，且瓶底有沉淀，说明乳糖被发酵，将其置于4 ℃冰箱中冷藏1 h后，也均呈液体；(5)乳糖-亚硫酸盐确证试验，各试管底部均出现黑色沉淀，且导管中均充满大于1/4的气体。以上5项性能验证试验结果，均与目前现行有效的3种标准中，所列出的阳性现象一致。部分性能确证试验结果如表3所示。

表3 不同培养基传代产物开展性能确证试验结果汇总Tab.3 Summary of Experimental Results on Different Properties of Subcultured Products in Different Media

2.3 样品的检测

取南方某水司双水厂的出厂水和水源水样品均100 mL，0.45 μm滤膜过滤后，用无菌镊子将滤膜置于提前浇注好的TSC琼脂和显色培养基平板上；取南方某污水处理厂进水和二沉池出水(稀释1 000倍)样品1 mL，用平板浇注的方法，分别用TSC琼脂和显色培养基浇注平板，待琼脂凝固后，均分别覆盖1层TSC琼脂和显色培养基。培养结果如表4和图2所示。

表4 用TSC琼脂和显色培养基培养的检测结果Tab.4 TSC and Chromogenic Medium Plate Test Results of Tap Water, Source Water and Effluent Water

图2 水源水2和污水二沉池出水用TSC琼脂和显色培养基培养结果图Fig.2 Culture Results of Source Water 2 and Effluent from Secondary Sedimentation Tank of Sewage Plant with TSC Agar and Chromogenic Medium

由表4可知，2个水厂的出厂水，无论是用TSC琼脂浇注，还是用显色培养基，均无特征菌落，符合《生活饮用水卫生标准》的要求。水源水1和水源水2的滤膜，用TSC琼脂培养分别检出3个和32个黑色特征菌落，而用显色培养基培养均未出现橙色特征菌落。对TSC琼脂中的这3个和32个黑色特征中的3个和5个特征菌落，分别进行FTG培养和LS确证试验，试验结果均未出现阳性反应特征，说明这些黑色的特征菌落均不是产气荚膜梭菌，与显色培养基结果一致。

污水厂进水稀释1 000倍后，在TSC平板中有18个黑色特征菌落，显色培养基中有17个橙色特征菌落。对18个黑色特征菌落中的5个进行增菌和性能验证，结果均为阳性，即这18个黑色特征菌落均为产气荚膜梭菌，这和显色培养基的结果非常接近。污水厂二沉池出水的TSC琼脂平板中有28个黑色特征菌落，显色培养基中有21个橙色特征菌落。通过对28个黑色特征菌落中的5个进行增菌和性能验证后，显示其中1个菌落为阴性，根据标准中的计算方法[7]，得出该1 mL样品中的产气荚膜梭菌数量为22个，这和显色培养基得出的21个橙色菌落也非常接近。

3 结论

(1)《生活饮用水卫生标准》中关于产气荚膜梭菌的限量要求是0 CFU/(100 mL)，如果参考GB 4789.13—2012和SN/T 0177—2011的取样方式，选用1 mL样品的检测量，很有可能造成漏检的风险。因此，建议出厂水取样量为100 mL，以保证最大检出率，可参考GB/T 8538—2008的膜过滤培养方式进行检测。水源水或污染严重的样品，视情况决定是否稀释，如果稀释倍数达到或超过100倍，可直接取1 mL样品，选用平板浇注法进行检测。

(2)TSC培养基、FTG培养基和疱肉培养基，均可使产气荚膜梭状芽孢杆菌的菌种复苏和性能恢复。由于疱肉培养基配制复杂，且在3个标准中，均未涉及，推荐使用FTG培养基或者TSC培养基，以此来简化试验操作流程和实验室的培养基储备种类。

(3)含铁牛乳确证试验在有氧和厌氧条件下培养，均可出现剧烈发酵现象，因此，厌氧装置不够时，可直接有氧培养。但需注意，不可将1 mL培养液直接接种至含铁牛乳培养基表面，而应接种至含铁牛乳培养基内部。可通过搅拌等方式，使培养物与含铁牛乳培养基充分接触，否则就算是阳性培养物，也不会出现剧烈发酵的现象。这可能是由于培养物被含铁牛乳培养基充分包裹，间接形成了厌氧环境，当有氧培养时，也会出现阳性反应特征。

(4)本文通过对实际样品的检测，发现显色培养基和传统培养方法对阳性样品的检测结果非常接近。使用显色培养基可明显简化检测流程、缩短检测时间。表5对传统检测方法和显色培养基检测法的部分差别进行了汇总。

由表5可知，显色培养基在缩短检测时间和降低培养基种类方面，均优于传统检测方法。厌氧亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌，经过TSC或SPS培养基厌氧培养后，均可生成黑色特征菌落[11]。因此，需对黑色菌落开展诸多性能验证试验，确认是否为产气荚膜梭菌。传统的检测方法，1个稀释度的样品可能需对5个特征菌落进行培养和验证；污染较严重的样品，涉及到几个稀释度时，可能需对多个稀释度的各5个特征菌落进行增加和性能验证，检测量非常大。当待检样品多、样品污染较严重，需稀释时，更推荐使用产气荚膜梭菌的显色培养基来缩短检测时间和步骤。