基于Maillard反应的发酵黑化技术在果蔬加工中的研究进展

张琳，高琳，张仁堂

(山东农业大学 食品科学与工程学院，山东省高校食品加工技术与质量控制重点实验室，山东 泰安 271018)

果蔬等农产品加工产业是我国食品工业的重要组成部分，而我国果蔬产品的主要加工方式依然是较为传统的脱水、冷冻、腌渍和罐藏等，这样的加工方式使得果蔬产品的相对附加值较低。我国果蔬播种面积在2017年已达3111.7万公顷，相较于2013年增长了28%[1]，这意味着我国果蔬产业已经进入到了快速发展的阶段，这也为果蔬加工业带来了新的机遇和挑战。果蔬产业的快速增长为果蔬加工企业带来了充足的加工原料，但由于相对固定的产品种类，导致市场已经趋于饱和。若果蔬加工企业不进行加工技术的创新，将会导致大量果蔬产能过剩，从而影响到种植户的收益及整个果蔬产业的发展。因此，果蔬加工业的高效发展不仅需要从源头上提高果蔬的品质，更需要开发出更多适宜果蔬加工的新技术，发酵黑化技术便由此应运而生。

发酵黑化技术是一种以美拉德反应(Maillard reaction，MR)为主的自身发酵技术，因其操作简单、方便，故可广泛用于加工还原糖含量较高的果蔬。同时，随着消费者对“黑色”食品的越发关注，越来越多的消费者开始接触并认可发酵黑化果蔬产品，如发酵黑蒜、发酵黑化红枣等，这也为发酵黑化果蔬产业的发展奠定了坚实的市场基础。

1 发酵黑化技术

1.1 发酵黑化的原理

发酵黑化是在高温高湿且不添加任何添加剂的条件下，利用美拉德反应，使食品中蛋白类氨基化合物与糖类羰基化合物反应生成褐色大分子含氮化合物——类黑精和大量小分子物质的一类自身发酵反应。在发酵过程中多糖不断分解为单糖和双糖，使食品的甜度得到增强。而酚类化合物、类黑精和杂环化合物含量的增加，使食品的抗氧化能力得到增强[2]，从而在功能作用方面有较大提升。此外，食品中的蛋白质分解为游离氨基酸，有机酸含量也得到增加，使得其口感和风味变得更加丰富。

由于美拉德反应较为复杂，国内外对于其反应机理、路径和产物的相关研究还不清晰。美国化学家John Hodge也仅对美拉德反应机理做了初步解释，并将其分为初期反应、中期反应和后期反应三个阶段[3]，但其中间产物和整个过程仍缺乏科学合理的解释。目前，大部分针对美拉德反应的研究都是基于模式美拉德体系[4]，以单种氨基化合物和单种羰基化合物分别作为底物进行反应产物的研究。而在实际生产过程中，由于参与美拉德反应的底物较为多样且反应条件各不相同，因此反应产物也较为丰富，可大致分为含氮杂环化合物、环状烯醇化合物、多羰基化合物和单羰基化合物[5]。因此，不同的食品经发酵黑化得到的反应产物和发酵黑化效果也并不完全一致，这与参与美拉德反应的氨基酸和糖的种类及数量有关，参与反应的氨基酸和糖的种类越多，反应产物的风味越丰富[6]。

1.2 发酵黑化的分类

1.2.1 固态发酵黑化

固态发酵黑化是指对物料只进行简单的物理修整并保留其原有状态，在高温高湿的条件下进行恒温或变温的一种自身熟化发酵。在果蔬发酵黑化加工中，固态发酵是最常用的方法。固态发酵黑化工艺流程主要包括挑选修整、清洗、水分调整、高温高湿发酵、杀菌包装等步骤，其中前处理和高温高湿发酵是影响产品质量的重要因素[7]。果蔬品种的筛选、修整或切分后体积的大小、发酵时温湿度的把控等对最终产品的品质有着直接影响。因此，相较于液态发酵，固态发酵的品质控制难度更高。但经固态发酵黑化后的产品在再加工性上强于液态发酵黑化产品，且果蔬整体利用率更高。

1.2.2 液态发酵黑化

液态发酵黑化是对果蔬进行破碎后或加水破碎后，在高温高湿条件下进行恒温或变温的一种自身熟化发酵。液态发酵黑化工艺流程主要包括挑选清洗、修整破碎、调整发酵环境、密封高温发酵、无菌包装等步骤。相较于固态发酵，液态发酵最显著的优势体现在缩短了发酵时间和提高了发酵可控性及发酵度。此外，相关研究发现液态发酵可显著提高发酵物中的总酚等活性物质的含量[8]，这对产品的抗氧化功效有较大的提升作用。

2 发酵黑化技术在果蔬加工中的应用

2.1 黑蒜的加工

成品黑蒜色泽黑亮，口感酸甜[9]，且无大蒜原有的辛辣味和刺激性气味。相较于大蒜，黑蒜在抗氧化方面有显著提高[10-11]，具有一定的保健作用。我国的黑蒜加工技术最早是由韩国、日本引进，后经不断改良和优化，如今国内发酵黑蒜的加工工艺已较为成熟。按照发酵时间的长短，可分为传统发酵和快速发酵两种发酵方式；按照发酵方式，可分为固态发酵和液态发酵，国内黑蒜的生产以固态发酵为主；按照不同的预处理方式，可分为微波预处理制备黑蒜、低温冷冻预处理制备黑蒜、高温预处理制备黑蒜、超高压预处理制备黑蒜等[12-18]。此外，不同品种大蒜加工得到的黑蒜，其感官品质也不尽相同[19]。姜雪[20]研究发现，多瓣黑蒜产品中的水分、氨基态氮和总酸含量均高于独头黑蒜产品，而独头黑蒜中的5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethyl furfural，5-HMF)、还原糖和总酸含量则高于多瓣黑蒜。

2.2 发酵黑化红枣的加工

发酵黑化红枣是利用发酵黑化原理加工制备而成[21]，制得的黑枣酸甜可口、枣香味浓郁[22]。孙欣等[23]研究发现，相较于红枣，黑变发酵枣中果糖、葡萄糖等还原糖含量和总酸含量有所增加；多糖、总酚、三萜酸、氨基酸和5-HMF等功能成分也有所增加[24]；具有焦糖气味的2-乙酰呋喃(2-acetyl furan)、糠醛(furfural)及其衍生物等明显增加，使黑变红枣枣香味更加丰富。由于在加工过程中类黑精的集聚，从而导致发酵黑化红枣在感官特征上表现为黑色，且与天然黑枣不同的是其黑色同时表现在枣皮和枣肉上。此外，发酵黑枣在抗氧化等活性功能上有着显著提高[25]，Ju-Yeon H等[26]利用1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)、超氧化物歧化酶(SOD)类活性、邻苯三酚、亚硝酸盐清除能力和黄嘌呤氧化酶对红枣和发酵黑枣提取物的抗氧化活性进行了研究，发现发酵黑枣的综合抗氧化能力显著优于红枣。

2.3 黑洋葱的加工

黑洋葱是将洋葱经前处理、控温自然发酵黑化后制得的一种洋葱深加工产品[27]，在发酵黑化过程中不仅去除了洋葱的刺激性气味，还提高了其抗氧化能力[28]，而美拉德反应产物中大量存在的糠醛和吡嗪赋予了黑洋葱独特的风味[29]。宁月宝等[30]研究发现，洋葱中的蒜氨酸和脱氧蒜氨酸等含硫化合物在发酵过程中会发生降解，而正是这些复杂的挥发性含硫化合物的降解消除了洋葱中原有的刺激性气味。Alicia等[31]研究发现在发酵黑化过程中，黑洋葱中的主要有机硫化合物——异蒜素含量急剧增加，而黄酮含量显著降低；果糖和葡萄糖的显著增加使黑洋葱更加甜口。此外，黑洋葱中有机硫化物和多酚等活性物质有所增加，能提高对自由基的清除能力，起到降低血糖活性、缓解糖尿病、降低胆固醇、抑制细菌繁殖、延缓衰老和预防癌症等作用[32-34],可作为一种天然的抗氧化剂。

2.4 熟化黑枸杞的加工

熟化黑枸杞又称为熟制黑枸杞，胡云峰等[35]采用前期预处理、中期熟化处理和后期干燥定型处理三步热处理工艺，加工得到色泽黑褐、口感酸甜药香味浓郁的熟化黑枸杞。熟化黑枸杞不同于自然生长的黑枸杞，其所表现的黑色是由于加工过程中美拉德反应产物的集聚所致，如类黑精等。在熟化过程中，枸杞中总酚和黄酮含量随时间不断升高，总酚含量由10.34 mg GAE/g上升到22.94 mg GAE/g，黄酮含量也由1.88 mg RE/g上升到8.10 mg RE/g，使得其抗氧化能力得到显著提升；此外，熟化黑枸杞中较高含量的2-甲基丁醛(2-methylbutyraldehyde)、糠醛及3-甲基丁醛(3-methylbutyraldehyde)等挥发性化合物赋予了熟化黑枸杞独特的药香味[36]。

2.5 黑荸荠的加工

黑荸荠是以新鲜荸荠为原料，采用变温发酵黑化技术熟化制成[37]。经发酵黑化后的黑荸荠不仅提高了某些特定营养物质的含量，如还原糖和多糖等，在酚类和类黑精等功能活性物质的含量上也有所增加，尤其是类黑精的积累最为显著。而类黑精的积累提高了产品的抑菌性、抗氧化性和抗肿瘤等功效[38]，由此赋予了黑荸荠一定保健功能。魏连会等[39]研究发现，相较于鲜荸荠，黑荸荠中增加了一种必需氨基酸——蛋氨酸(Met)和一种还原性氨基酸——半胱氨酸(Cys)，从而使得黑荸荠在营养价值上有所提高。此外，黑荸荠中新增加的挥发性产物——冰片(borneol)使得黑荸荠具有清热止痛、开窍醒神等功效。

2.6 其他果蔬的加工

除了上述的果蔬种类外，发酵黑化技术还在其他“黑色”果蔬食品的加工过程中有所应用。姬妍茹等[40]将鲜菊芋洗净，切成3.0 cm左右的厚片，自然晾干后封于耐高温的塑料袋中进行变温发酵，制得的黑菊芋色泽黝黑、口感香甜软弹。但也并不是所有果蔬均可进行发酵黑化，这类果蔬必须要有较高的含糖量，尤其是对还原糖的含量有着较高要求。相关研究发现，以淀粉和蔗糖为主要糖分的马铃薯和甜菜，发酵黑化加工后口感不佳；而以果聚糖为主要糖分的菊芋，发酵黑化加工后口感香甜。因此，在选择发酵黑化原料时，需要准确把握原料中的糖分组成及占比，还原糖的含量对发酵黑化后产品的品质有着重要的影响。

3 发酵黑化技术存在的问题

3.1 蛋白质、矿物质等营养物质的损失

在发酵黑化过程中，果蔬中的蛋白质分解为游离的氨基酸并与羰基化合物发生美拉德反应，而蛋白质作为反应底物不断被消耗，从而导致蛋白质的损失[41]和营养价值的降低[42]。此外，果蔬中一些重要的矿物质易与美拉德反应物的中间产物发生螯合反应，生成难溶化合物，从而降低食品中矿物质的生物活性，尤其是Ca2+、Mg2+极易与氨基酸结合形成无活性化合物[43]。与此同时，在高温条件下果蔬中的维生素、花青素等也极易遭受破坏。故此，发酵黑化果蔬存在着蛋白质、矿物质等营养成分损失的问题。而目前对如何解决发酵黑化引起的营养损失的相关研究还较少。在实际生产过程中，可在发酵黑化前适当添加反应底物或发酵黑化结束后添加营养补充剂，以弥补产品因加工生产工艺而造成的营养流失。

3.2 发酵黑化产物的安全性

果蔬在进行发酵黑化时，生成的发酵产物较为复杂，若不对反应进行严格控制，还会生成抗营养物质或具有致病性的有毒物质，如丙烯酰胺(acrylamide，AA)[44]、晚期糖基化末端终产物(advanced glycation end products，AGEs)[45-46 ]、呋喃(furans)和5-HMF等。

3.2.1 丙烯酰胺(AA)的生成

在果蔬的发酵黑化过程中，AA的生成主要包括以下3条途径：葡萄糖和果糖等还原糖与天冬酰胺发生美拉德反应生成Schiff 碱，再分别以Strecker降解途径和N-糖苷途径形成AA[47]，且随着温度和湿度的增加，其含量也会随之增加[48]；在酸性高温的条件下，HMF直接与天冬酰胺发生反应生成 AA[49]；果蔬中单糖在加热后发生焦糖化反应，产生大量的小分子醛(如甲醛、乙醛等)，进而生成丙烯酸，最终形成 AA[50]。目前，已有研究表明AA对动物具有神经毒性、生殖毒性和致癌性[51]，国际癌症研究机构(IARC)也将AA列为 2A类致癌物。

对于果蔬发酵黑化过程中AA的调控，可通过调整加工条件和添加抑制剂等措施来抑制AA的产生，如降低热处理温度或时间、降低反应pH和添加天然抗氧化剂、外源氨基酸、金属离子等添加剂[52-58]。此外，项雷文等[59]研究发现，模式美拉德反应产物对AA的量和毒性有削弱作用，这为评估基于美拉德反应加工的食品安全性提供了一个新的视角。

3.2.2 晚期糖基化末端终产物(AGEs)的生成

AGEs是还原糖与氨基化合物通过美拉德反应等途径生成的一系列结构复杂的化合物的总称[60]，包括glyoxal derived lysine dimer(GOLD)、methylglyoxal derived lysine dimer(MOLD)、羧甲基赖氨酸(Nε-carboxymethyl-lysine,CML)、羧乙基赖氨酸(Nε-carboxyethyl-lysine,CEL)、戊糖素(pentosidine，PTD)和吡咯素(pyrraline)等[61]。Uribarri等[62]研究发现，糖尿病、阿尔茨海默症等疾病的发生均与AGEs 的蓄积有密切联系。

对此，可利用天然提取物来抑制果蔬发酵黑化过程中AGEs的产生和积蓄，Sampath等[63]研究发现根皮素(phloretin)、表没食子儿茶素(epigallocatechin，EGC)、3-没食子酸酯(epigallocatechin 3-gallate，EGCG)和6-姜辣素(6-gingerol)在细胞和动物体内对AGEs积蓄均有很好的抑制效果；李书艺等[64]也研究了荔枝果皮原花青素(litchi pericarp procyanidins，LPPC)对AGEs的抑制作用，发现LPPC对AGEs的抑制率显著高于维生素C(Vc)和氨基胍(aminoguanidine)，可将其作为一种新的AGEs天然抑制剂进行深度开发。

3.2.3 呋喃的生成

在高温高湿条件下，果蔬中的碳水化合物易发生热降解和重排，从而生成大量呋喃类化合物，如丝氨酸、苏氨酸和蔗糖在高温下生成的产物中就可检出350多种呋喃化合物[65]。Elif等[66]通过临床老鼠实验和形态计量学统计，发现呋喃化合物会对老鼠上皮高度和生殖器官官腔直径产生影响，这些现象表明呋喃对雄性生殖系统有毒害作用。虽然还没有直接研究发现呋喃会对人体造成相同的危害，但这也足以引起人们的重视和警觉[67]。

在果蔬发酵黑化加工生产中，可适量添加一些抑制呋喃生成的化合物，如天然活性物质、抗氧化剂等[68]。张璐[69]研究发现茶多酚对葡萄糖-丙氨酸模型中呋喃的生成具有显著抑制作用；吴思佳[70]通过毒理学实验和葡萄糖-丙氨酸低湿体系筛选了5种天然植物源成分，其中和厚朴酚(honokiol，HNK)对呋喃抑制效果最佳，且对由呋喃引起的小鼠肝、肾损伤有一定的保护作用；毕可海[71]利用美拉德溶液模拟体系研究发现抗氧化剂可与葡萄糖结合，从而抑制了葡萄糖与丙氨酸之间美拉德反应的发生，进而影响中间产物果糖胺的生成，最终抑制呋喃的产生。

3.2.4 五羟甲基糠醛(5-HMF)的生成

目前，国内外研究学者对于美拉德反应产物中5-HMF的安全性还存在争议，在5-HMF的体内、外安全性研究实验中，所得结论也并不一致。在体外实验中，5-HMF易转化为 5-亚磺酰甲基糠醛(5-sulfoxymethylfurfura ，5-SMF)，其遗传毒性结果显示为阳性[72]，Glatt等[73]研究发现5-HMF对细菌和哺乳动物细胞具有损伤基因及诱发突变的效应，其机理是与细胞核中的DNA、RNA和蛋白质等重要物质发生相互作用，由此可能会对这些大分子物质造成结构性损伤，从而具有致毒性和致突变性。但在体内实验中5-HMF的遗传毒性结果显示为阴性72，Durling等[74]通过彗星试验发现，只有在加入硫酸转移酶(sulfotransferase，SULT)后，高剂量下5-HMF对人Caco-2、HEK293细胞，小鼠L5178Y细胞和中国仓鼠V79、V79-hP-PST(高表达人SULT活性) 细胞才会导致显著的DNA损伤。因此，机体内在无SULT的情况下，5-HMF无法表达遗传毒性[75]，但其存在的潜在风险也足以引起人们的重视。

因此，为保证发酵黑化果蔬产品的安全性，需对产品中5-HMF的含量进行严格控制。目前，缓解食品中5-HMF生成的主要途径有减少反应前体物质和添加外源化合物[76]，而添加外源化合物在果蔬发酵黑化加工中是最为直接有效的方法。研究发现，绿原酸(chlorogenic acid)[77]、没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)和表儿茶素(epicatechin，EC)对HMF的生成均有较好的抑制效果[78-80]；此外，阿魏酸(ferulic acid)、儿茶素(catechins)和原花青素(procyanidins，PC)等天然抗氧化剂对HMF的抑制作用也在不断探索中，利用天然化合物抑制发酵黑化过程中HMF的产生也将是下一步的研究重点。

4 结论与展望

随着对美拉德反应的深入研究，美拉德反应不仅被用于香辛料和烟草增香剂的生产，在发酵黑化果蔬产品的生产中也被广泛应用。特别是随着对发酵黑蒜研究的深入，发酵黑化技术在黑蒜的生产实践中已变得较为成熟，黑蒜也是目前最为常见的发酵黑化果蔬产品。近年来，国内外对其他果蔬的发酵黑化研究也越来越多，如发酵黑化红枣、洋葱、枸杞等，这表明发酵黑化技术在果蔬深加工产品的生产中已取得显著阶段性成果和实际性研究进展。

发酵黑化在果蔬加工中的兴起为我国果蔬加工业提供了一条全新的加工思路，丰富了我国果蔬深加工产品的种类，对整个果蔬产业的发展也起到一定的刺激作用。此外，发酵黑化技术赋予了果蔬产品独特的功能性，其抗氧化能力得到较大提升，也为保健食品的开发提供了新的思路。虽然我国对发酵黑化果蔬的研究起步较晚，在实际生产中还存在部分问题，尤其是对于果蔬发酵黑化过程中发酵产物的风险性和安全性的控制。但随着对发酵黑化技术的深入研究和不断完善，发酵黑化果蔬的加工技术变得越发成熟，发酵黑化果蔬产品也受到了越来越多消费者的关注，这对发酵黑化技术在果蔬加工中的应用和推广有着重要意义。