大豆水解蛋白中抗氧化肽的研究进展

刘辉，童星

(1.佛山市海天调味食品股份有限公司，广东 佛山 528000；2.广东海天创新技术有限公司，广东 佛山 528000)

食品在贮运过程中易发生油脂氧化导致食物色泽改变，产生腐臭味，破坏食品体系的稳定性。有研究表明，在食品中添加抗氧化肽可抑制脂质过氧化，防止食物酸败，从而保持食品的营养价值及新鲜度[1]。

周芳等[2]研究豆豉发酵过程中的抗氧化值变化主要是由大豆蛋白变化引起的。王俊[3]将豆粕酶解后的抗氧化肽应用于肉丸中，能有效抑制肉丸中脂肪和蛋白质氧化。夏蓉等[4]研究花生醋中抗氧化成分主要来源于花生蛋白的水解，可有效保护花生酱的色泽。

大豆作为一种十分重要的经济作物，同时也是一种富含多种营养的天然补品，其生物学功能越来越受到重视[5]。大豆中的营养成分既包括多种人体必需氨基酸、矿物质元素、蛋白质、油脂、固醇和维生素E等初级代谢产物，还包括大豆异黄酮、皂甙、植物等次级代谢产物，丰富的营养物质为大豆的开发提供了更多的应用前景[6]。

大豆功能性成分主要分为两大类：一类是以大豆异黄酮为代表的化学物质；另一类是以水解大豆蛋白为代表的肽类。大豆异黄酮具有激素类性质，其应用受到极大限制[7]。因此，水解大豆蛋白的生物学功能受到更为广泛的关注，本文主要综述水解大豆蛋白中抗氧化肽的方法、抗氧化肽的结构以及抗氧化主要机理。

1 大豆蛋白中抗氧化肽的获取方法

1.1 酶解法

蛋白质功能性改良方法中，酶水解是应用最为广泛的方法之一，其主要用于疏水蛋白乳化，增强蛋白质营养价值[8-9]。Saito等[10]酶解大豆β-球蛋白和球蛋白后获得两种三肽抗氧化肽。Coscueta等[11]用Corolase PP酶水解脱脂大豆蛋白，获得分子量<3 kDa的大豆肽具有很强的抗氧化活性。Castro等[12]采用多种微生物蛋白酶水解大豆分离蛋白，结果表明水解大豆分离蛋白肽抗氧化活性比水解前提高了7倍。Oliveira等[13]采用蛋白酶组合方法水解大豆分离蛋白能有效提高其抗氧化活性、乳化活性及起泡能力。酶的水解作用还要依靠不同物理和化学条件配合才能起到更好的作用。

1.2 化学法/物理法

化学法水解大豆蛋白多采用强酸或强碱法水解，由于反应条件苛刻，易腐蚀设备等不利因素，化学方法已经很少应用于水解大豆获得大豆肽。物理法水解大豆蛋白主要是利用物理条件配合蛋白酶水解，如pH、温度、压力等。Guan等[14]采用高静压技术配合蛋白酶水解大豆蛋白，其技术主要是利用高静压引发大豆蛋白构象和结构改变，同时降低在水解过程中的微生物污染，结果表明，在200 MPa水解4 h能有效提高大豆水解肽的抗氧化活力。Oliveria等对酶水解条件进行优化，结果表明，在45 ℃水解条件下，大豆蛋白的抗氧化能力最强，其中温度对酶水解后抗氧化活性的影响大于pH对于酶水解后抗氧化活性的影响。

1.3 生物法

生物法发酵大豆蛋白产抗氧化肽的方法主要有两种：第一种是通过微生物生长过程中产生的蛋白酶水解大豆，其和1.1中论述酶法相同，在此不赘述。第二种是以大豆蛋白为底物利用水解大豆蛋白后的小肽或氨基酸合成新的抗氧化肽。Amadou等[15]利用植物乳酸杆菌Lp6发酵脱脂大豆，获得5种抗氧化活性较强的多肽。Chi等[16]研究芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌发酵脱脂大豆后产生生物抗氧化活性，其中芽孢杆菌发酵产物的抗氧化活性最强，酵母菌和乳酸菌在发酵前后都没有明显改变抗氧化活性。Yang等[17]利用解淀粉芽孢杆菌发酵脱脂大豆，分析大豆异黄酮、多酚以及分子量<3 kDa的肽，发现肽类能有效提高抗氧化活性。这也表明多肽的抗氧化活性，是受多种因素共同影响的结果，其中包括分子质量、氨基酸组成和氨基酸序列[18]。

2 影响多肽抗氧化活性的因素

2.1 氨基酸组成

氨基酸组成对多肽抗氧化活性起到关键性作用，某些氨基酸是抗氧化肽的活性位点。此类氨基酸主要包括以下3种。

2.1.1 环类氨基酸

含苯环的氨基酸(如色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)能够为自由基提供质子，减缓自由基链式反应；此外，此类氨基酸能够通过共振作用维持自身稳定[19]。

2.1.2 酸性氨基酸

酸性氨基酸(如天冬氨酸和谷氨酸)带负电，可以和金属离子相互作用(如螯合作用)，形成复合物，抑制氧化。

2.1.3 碱性氨基酸

碱性氨基酸组氨酸由于咪唑基的降解，使得其具有自由基清除能力；赖氨酸是电子受体，能够接受不饱和脂肪酸氧化过程中产生的自由基的电子[20]。

2.2 分子质量

抗氧化肽的分子质量是决定抗氧化活性的关键因素之一。大多数抗氧化活性的多肽含有2～20个氨基酸，其抗氧化活性远比它们的亲本蛋白质分子(20～50个氨基酸)具有更强的抗氧化活性。Moure等研究的豆渣蛋白水解产物的4个不同分子质量组分(5～10 kDa、10～30 kDa、30～50 kDa和>50 kDa)中，低分子质量组分(5～10 kDa)具有较高的抗氧化活性，然而分子质量>10 kDa的组分表现出最弱的抗氧化活性[21]。类似地，Chen等[22]水解大豆7S蛋白，获得6种多肽，其中前3种抗氧化活性最强，其分子量都<1 kDa，但是Val-Ile-Pro-Ala-Gly-Try-Pro序列无抗氧化活性，Chen等[23]利用化学合成方法分析相同分子量不同氨基酸序列对抗氧化活性的影响，结果表明氨基酸序列对抗氧化活性有关键作用。同时也说明抗氧化活性不仅与分子量有关，还有氨基酸序列有关。

2.3 氨基酸序列

除了存在特异性氨基酸之外，氨基酸在肽序列中的位置也是至关重要的。肽的氨基酸序列取决于蛋白质来源、蛋白酶特异性、蛋白质水解程度和水解条件。N端和C端氨基酸对其抗氧化活性有很大影响，N端的疏水氨基酸能够增加肽的抗氧化活性主要为缬氨酸、亮氨酸、甘氨酸[24]。C端氨基酸常为色氨酸、谷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸和酪氨酸[25]。组氨酸在N端主要通过螯合金属离子方式展现抗氧化能力，而在C端是以清除自由基方式展现抗氧化能力[26]。在三肽的C端含有色氨酸和酪氨酸，具有很强的自由基清除能力，如果三肽中含有半胱氨酸同样具有很强的自由基清除能力。在大分子蛋白中半胱氨酸是以SH形式存在，其抗氧化活性明显高于不含有—SH的[27]。

3 主要作用机理

3.1 抗氧化肽的作用机理

抗氧化肽能起到抗氧化作用是因为低分子质量的抗氧化肽比其庞大的亲本蛋白质更容易接近自由基，并能抑制自由基介导的过氧化。抗氧化肽清除超氧化物(ROS)和自由基的机理主要有：(1)通过抗氧化肽的肽键和羟基提供氢原子或电子，清除缺少氢离子或电子的自由基，如ROS和自由基，以消除其对生物分子的破坏作用；(2)通过抑制某些促氧化酶和螯合参与催化自由基生成的过渡金属离子来抑制ROS和自由基形成[28]。抗氧化肽通过抑制自由基转化为过氧化氢，通过内源性抗氧化剂(包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽)能够将其分解为无害的代谢产物，如水和氧[29]，例如，Szeto Schiller-31(SS-31)肽可渗透细胞，靶向线粒体，保护线粒体免受细胞氧化[30]。SS肽的功能归因于它们独特的结构域，并含有芳香族和碱性氨基酸[31]。一些抗氧化肽的独特结构域使得它们比其他亲脂性抗氧化剂(如维生素E)更能有效清除细胞中的自由基[32]。

目前，抗氧化肽的作用机理与结构关系依据处于研究阶段，Jia等[33]认为具有两亲性的α-螺旋是抗氧化的主要结构。Duan等[34]认为β-折叠是抗氧化肽体现抗氧化性的主要结构。Zou和Nwachukwu等[35]认为抗氧化肽的二级结构，如：α-螺旋、β-折叠对于抗氧化性的影响相当微弱，一般抗氧化肽含有4～6个氨基酸，其表现二级结构并不明显，因此其抗氧化机制在很大程度上取决于其氨基酸的组成。

3.2 氨基酸抗氧化作用机理

多肽由不同种类的氨基酸组成，多肽发挥抗氧化活性氨基酸起到主要作用，氨基酸抗氧化活性的特征主要依靠其化学基团作用，疏水基团能有效地抑制过氧化氢基，而酸性基团及其类似物能有效抑制过氧化亚硝基[36]。各种氨基酸抗氧化作用机理见表1。

表1 氨基酸抗氧化作用机理Table 1 The antioxidant mechanism of amino acids

氨基酸抗氧化性与其性质、电荷、碱基、芳香基团和疏水性有关键性密切的关系，其自身的构象也会影响其抗氧化的性质[42]。Chen等研究发现D-His替换L-His导致其抗氧化活性发生显著性变化。他们认为咪唑基团的位置是抗氧化活性的关键。氨基酸的抗氧化活性之间也存在协同和拮抗作用，并不是将抗氧化活性强的氨基酸组合后，其抗氧化活性很强，因此对于氨基酸抗氧化的性质值得持续关注[43]。

4 结论与展望

目前，很多天然原料都是抗氧化成分的来源，例如：金丝小枣、鸡枞菌、洋葱、玉米等[44-47]，天然原料的应用不仅清洁标签，使产品更具有自身特色，而且提升相应产品的功能性。抗氧化肽也可作为独立产品用作保健食品，刘恩岐等[48]应用黑豆抗氧化肽明显缓解运动由自由基引发的体力疲劳。豆类为原料提供蛋白，相对于其他蛋白质，具有价格低、氨基酸种类丰富、蛋白质组成明确等优点。因此，水解大豆蛋白产生抗氧化肽在大范围工业化应用中具有巨大的应用潜力。酶法和生物法是最有效的获得抗氧化肽的方法，而酶法因其易质控、目标肽单一、时间短、作用快等特点，越来越受到工业化生产的重视，在未来很有可能替代生物发酵法成为大豆抗氧化肽的工业化生产方法的最佳方法。目前抗氧化肽还存在一些问题有待解决：抗氧化肽中疏水性氨基酸具有苦涩味，会影响其在食品中的应用；抗氧化肽加入食品后与食品中其他成分反应，影响其保质期；大部分抗氧化肽研究依然属于实验室阶段。随着生物信息学以及基因编码技术的发展，研究人员会运用更多技术改良抗氧化肽，并通过表达来实现抗氧化肽在食品中的应用。