血浆微泡乳腺癌耐药蛋白mRNA水平对乳腺癌化疗疗效的预测价值

魏 娜，倪 青，戴 民，王 舒，侯 净，陈 欢 (贵州省人民医院乳腺外科，贵州 贵阳 550002)

目前，乳腺癌已成为全球女性最常见的恶性肿瘤，临床对于此病多采取手术、放疗、化疗和内分泌等综合治疗，其中新辅助化疗在乳腺癌的治疗中有重要作用，如可使部分无法手术的患者得到手术的机会，降低肿瘤期别[1]。然而由于患者的个体差异，其对化疗的敏感性也各不相同，若接受到无效或低效的新辅助化疗，不但影响最终疗效，也在无形中增加患者的经济负担与精神压力[2]。因此，如何有效预测患者的化疗敏感性，从而为患者选择最佳化疗方案具有重要意义。近年来，有研究提出，乳腺癌耐药蛋白(breastcancer resistance protein，BCRP)在预测乳腺癌化疗疗效中具有重要价值[3]，然而究竟有何价值，本文展开详细描述，现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料：选取2017年1月～2018年6月我院收治的65例乳腺癌患者设置为乳腺癌组，纳入标准[4]：①均符合乳腺癌诊断标准；②对本次研究项目知情同意；③无其他重要脏器功能受损；④意识清醒。排除标准：①妊娠期或哺乳期乳腺癌；②乳腺癌合并脑转移或肝转移；③患有其他肿瘤性疾病。患者年龄25～38岁，平均(32.51±5.28)岁，右侧乳癌36例，左侧29例；文化水平：初中及以下15例，高中32例，大专及以上18例。另选取该时间段内来我院体检的60例健康人群设置为对照组，年龄18～37岁，平均(31.78±5.15)岁，文化水平：初中及以下10例，高中33例，大专及以上17例。所选对象均自愿参与，近3个月内均未服用性激素类药物，无心脑血管病变及肝功能不全，且无其他自身免疫性疾病。本次研究工作获得了院内医学伦理委员会批准。两组对象的一般资料对比，差异均无统计学意义(P>0.05)，存在可比性。

1.2方法

1.2.1治疗方法:乳腺癌组所有患者术前均行空心针穿刺活检明确诊断并组织学标本接受病理科的免疫组化染色，化疗方案为EC-T：表阿霉素 90 mg/m2静脉滴注、环磷酰胺600 mg/ m2静脉滴注，序贯多西他赛100 mg/m2静脉输注。一个周期进行21 d，共行8个周期，对化疗后符合手术的患者按流程完成手术切除。

1.2.2仪器与方法:采用Invitrogen 公司生产的RNA 提取试剂；Promega生产的逆转和PCR扩增试剂(引物序列：R：5′-GACTGGATGAGGTCGTCCGTTTCC- 3′；F：5′- CAGCCGTGGAACTCTT TGGGTAGAGAAG-3′)；PCR 仪购自Bio-rad 公司；小鼠抗BCRP单克隆抗体购自Abcam，UK；乳胶珠购自美国Life Technologies 公司。

1.2.3标本采集:血浆微泡采集方法：收集两组对象入院当天晨血5ml，乳腺癌组需收集化疗前和完成所有化疗后两次血。要求其隔夜空腹10 h以上，静脉抽血，离心收集上清，将血清分装到干净的试管中，3 000 r/min(2 000 g)离心3 min，取上层清液5 ml，留血浆，按照血浆与磷酸盐缓冲液(PBS)1∶2 的比例稀释血浆样本，在分析之前，用20 μl PBS 重悬后保存在-80 ℃冰箱待用，分析时将标本于48 h内室温下复融，

1.2.4检测方法:微泡标本和组织标本分别用Trizol 裂解液提取总RNA，采用MMLV试剂盒进行反转录并得到cDNA 标本，按照实时定量PCR 方法进行扩增，得到扩增曲线并对基因的mRNA相对含量进行计算。

1.3观察指标：依据术后病理Miller-Payene分级系统评价新辅助化疗效果[5]，并将结果分为5个等级：1级：侵袭性癌细胞没有变化，或者只有个别癌细胞发生变化，癌细胞数量总体上没有减少；2级：侵袭性癌细胞略有减少，但总数仍然很高，癌细胞减少不超过30%；3级：浸润性癌细胞减少介于30%～90%；4级：侵袭性癌细胞减少90%以上，仅留下分散的小团癌细胞或个体癌细胞；5级：在原始肿瘤床中没有侵袭性癌细胞，但可能存在原位导管癌。

2 结果

2.1两组血浆微泡中BCRP mRNA 相对含量比较：乳腺癌组患者血浆微泡中BCRP mRNA 水平为(184.56±34.52)，而对照组为(62.35±16.62)，乳腺癌组明显更高，差异有统计学意义(t=10.345，P<0.05)。见图1。

★★P<0.001

2.2化疗前后患者血浆微泡中BCRP mRNA 相对含量与化疗疗效的关系：所有乳腺癌患者均顺利完成全部化疗，化疗后根据Miller-Payne分级标准，统计所有患者的病理反应性：1级11例，2级15例，3级17例，4级14例，5级8例。化疗前化疗反应为1级～3级组与4级～5级组患者的血浆微泡中BCRP mRNA 相对含量差异无统计学意义(P>0.05)；化疗后，化疗反应为1级～3级组血浆微泡中BCRP mRNA 相对含量明显高于4级～5级组患者，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 化疗前后患者血浆微泡中BCRP mRNA 相对含量与化疗疗效的对比

3 讨论

与以往传统的化疗方式不同，新辅助化疗是建立在手术基础上所采用的术前全身性化疗，旨在缩小肿瘤体积，降低肿瘤期别，为手术切除提供机会[6]。由于乳腺癌早期缺乏特异性症状，大部分患者就诊时已处于中晚期，耽误最佳手术治疗时机，因此，新辅助化疗则成为乳腺癌最主要的治疗方式，但化疗效果并不统一，期间仍有部分患者出现肿瘤进展，且一部分患者的新辅助化疗难以达到完全病理缓解(PCR)，延误治疗，造成出乎意料的麻烦[7]。鉴于此，越来越多的人致力于寻找一种经济可靠、可操作性强的新辅助化疗疗效的预测指标对新辅助化疗人群进行筛选，从而提高化疗有效率。

血浆微泡中BCRP是ATP结合膜转运蛋白家族的主要成员之一，相关试验表明BCRP可对多种化疗药物产生耐药性，其中包括拓扑替康、伊立替康以及米托蒽醌等。本文通过分析血浆微泡中BCRP在乳腺癌与正常人群中的表达水平，分析其对乳腺癌化疗疗效的预测价值。结果显示，乳腺癌组患者血浆微泡中BCRP mRNA含量高于对照组，由此可见，血浆微泡中BCRP可能参与乳腺癌的发生、发展，与之关系密切。为进一步明确血浆微泡乳腺癌耐药蛋白与化疗效果的关系，依据术后病理Miller-Payene分级系统，观察不同级别病理反应患者血浆微泡中BCRP mRNA 含量。结果显示，新辅助化疗后完全病理缓解的患者显著延长了无进展生存期，在化疗后4级～5级病理缓解的患者中血浆微泡中BCRP水平大大降低。提示血浆微泡中BCRP mRNA的含量可能与新辅助化疗的疗效有关。监测血浆微泡中BCRP mRNA水平对新辅助化疗对乳腺癌的疗效具有预测作用。这与既往的一些研究[8]结果基本一致。

综上所述，检测患者体内血浆微泡乳腺癌耐药蛋白mRNA 水平，将有助于乳腺癌的诊断以及化疗疗效的判断，该指标水平越高，则提示化疗效果越差，预后不佳，其有望成为乳腺癌化疗疗效的预测指标之一。