养心通脉方含药血清预处理内皮祖细胞对急性心肌梗死兔心肌bFGF、VEGF水平的影响

庞 延，卢健棋，朱智德，温志浩，梁逸强，韩景波，彭志林，林 浩

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是一种冠状动脉急性、持续性缺血缺氧引起心肌坏死的急危病症，虽然通过药物治疗、搭桥手术以及支架置入等有效干预治疗措施取得了实质性进展，但是在损伤心肌的功能恢复方面仍存在一定局限，预后不够理想。研究提示干细胞移植在治疗缺血性心脏病中具有巨大潜力，内皮祖细胞(endothelial progenitor cell，EPCs)能够通过分泌各种血管生成因子以及直接分化为内皮细胞，迁移到损伤部位并形成新的血管而改善心功能，但由于移植的EPCs在损伤组织中存活率较低，其临床试验结果并不令人满意。因此，寻找一种保护和促进移植EPCs发挥最大效能的药物具有重要意义[1-2]。前期研究表明，养心通脉方含药血清能够明显促进AMI兔骨髓EPCs增殖、迁移和黏附能力，而血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)被认为是调节内皮细胞增殖、活化和分化的重要因素之一[3-4]。本研究主要通过体内实验探讨养心通脉方含药血清预处理EPCs对AMI兔心肌bFGF、VEGF水平的影响，以期为中医药联合干细胞移植治疗缺血性心脏病提供一定临床思路和科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级健康雄性家兔39只，体质量2.0～2.2 kg，12周龄，由广西医科大学动物实验中心提供，实验动物合格证号：SCXK(桂)2009-0002。

1.2 药物、试剂及仪器 养心通脉方组成：红参、麦冬、五味子、当归、川芎、白术、桂枝、炙甘草各10 g，黄芪、白芍、丹参各15 g，木香、檀香各3 g，购于广西中医药大学第一附属医院，TRIzol Reagent(天根公司生产，批号DP424)，戊巴比妥钠 (Serve，批号：201505)，兔骨髓淋巴细胞分离液(天津灏洋公司生产，批号：2013LRA)，磷酸缓冲盐溶液(PBS，维森特公司生产，批号：311-010-CL)，荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测试剂盒(Genecopies，AOPR-1200)，人纤维连接蛋白(HFN，美国 Roche生产，批号：1105140700)，焦碳酸二乙酯(DEPC，Vetec生产，V900882)，胎牛血清 (FBS，Hyclone生产，批号:SV30087.01)，EPCs专用培养基 (EGM-2，Lonza生产，批号：CC-3202)，蛋白酶抑制剂混合物(弗德生物生产，FD1002)，BCA蛋白定量试剂盒(弗德生物生产，FD2001)，RIPA裂解液(弗德生物生产，FD008)，荧光定量PCR仪(ABI公司生产，货号7500)，微量核酸定量仪(Merinton公司生产，SMA4000)，小动物呼吸机(CKENTSCIENTIFIC ORPORATION公司生产，型号：RSP-1002)，EGC-6511型心电图机(上海光电医用电子仪器厂)等。

1.3 养心通脉方含药血清预处理EPCs培养液的制备 4只家兔取1只制备含药血清，含药血清组给予养心通脉方灌胃，参照《药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算》换算给药量为8 mL /(kg·d)[5]，每日2次，连续5 d，末次给药后无菌取血离心分离血清，灭活后备用。取3只家兔麻醉后从股骨干抽取骨髓组织，离心和洗涤获取单个核细胞(MNC)，以含10%FBS的EGM-2培养基接种到预先处理的培养瓶中培养，培养至第20天的EPCs用无血清培养基培养24 h 使细胞同步化，调整细胞密度至5×105个/mL，将10%养心通脉方含药血清置入含10%FBS的EGM-2培养基培养96 h制成养心通脉方含药血清预处理EPCs培养液[3]。

1.4 方法

1.4.1 AMI兔模型建立 SPF级健康雄性家兔腹腔注射1%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉，气管插管后连接小型动物呼吸机机械辅助通气，连接肢体导联观察心电图，行左侧胸廓切开术后撕开心包膜暴露心脏，找到左心耳位置，强光下暴露动脉血管，用7.0聚丙烯缝线于右室流出道和左心耳之间结扎左冠状动脉前降支中上1/3处，心电图可见ST段抬高，左心室心肌颜色逐渐由粉红色变暗苍白，将心脏回纳入胸腔，关胸后分别对肌层和皮层进行缝合，术后予青霉素抗感染。

1.4.2 家兔实验分组 将35只雄性SPF级兔随机选取5只家兔作为正常组，不做处理；随机选取5只家兔作为假手术组，只开胸穿线，不结扎左冠状动脉前降支；其余25只家兔进行AMI造模，造模成功后随机分为模型组、养心通脉方含药血清预处理EPCs心肌注射组(中药EPCs心肌注射组)、EPCs心肌注射组、养心通脉方含药血清预处理EPCs耳缘静脉注射组(中药EPCs耳缘静脉注射组)、EPCs耳缘静脉注射组，每组5只。

1.4.3 各组干预及细胞移植方法 正常组、假手术组、模型组不予干预；中药EPCs心肌注射组：将养心通脉方含药血清预处理的EPCs细胞混悬液浓度调整为8×105/mL，在建立AMI模型手术结扎冠状动脉15 min后，再次打开胸腔，分别于结扎区附近心肌组织分5点注射浓度为8×105/mL的养心通脉方含药血清预处理的EPCs细胞混悬液250 μL后关闭胸腔；EPCs心肌注射组：在建立AMI模型手术结扎冠状动脉15 min后，再次打开胸腔，分别于结扎区附近心肌组织分5点注射EPCs培养液1 mL后关闭胸腔；中药EPCs耳缘静脉注射组：建立AMI家兔模型后即刻从耳缘静脉注射浓度为1×107/mL的养心通脉方含药血清预处理的EPCs细胞混悬液；EPCs耳缘静脉注射组：建立AMI家兔模型后即刻从耳缘静脉注射EPCs培养液1 mL。术后2周处死各组家兔取心肌组织进行PCR、蛋白质印迹法(Western Blot)检测。

1.5 检测指标

1.5.1 PCR检测bFGF、VEGF的mRNA表达 提取总RNA，扩增mRNA，再逆转录为 cDNA，荧光定量 PCR 法检测bFGF、VEGF表达。引物合成由广州四和生物科技有限公司合成。VEGF引物序列：正向引物GCCGAGAAAGAGAAAAAGTG，反向引物GAGAGAGAGCAGGAGATACA，片段长度为163 bp；bFGF引物序列：正向引物GGAAGATGGACGGCTGCTGG，反向引物CGTTTCAGTGCCACATACCAA，片段长度为162 bp；Atcb(内参)引物序列：正向引物CTTCTAGGCGGACTGTTAGA，反向引物CCTTCACCGTTCCAGTTTTT，片段长度为179 bp。采用2-△△Ct法进行各基因表达的相对定量。

1.5.2 Western Blot检测bFGF、VEGF蛋白表达 提取蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒等试剂进行蛋白浓度测定，经上样→电泳→转膜→免疫反应→化学发光显色等处理后，利用Image J软件处理系统分析目标条带。

2 结 果

2.1 各组缺血心肌及梗死心肌区bFGF、VEGF mRNA表达比较 在梗死心肌区及缺血心肌区，中药EPCs心肌注射组和中药EPCs耳缘静脉注射组bFGF、VEGF mRNA 表达明显高于假手术组、模型组、EPCs心肌注射组、EPCs耳缘静脉注射组，差异均有统计学意义(P<0.05)，但中药EPCs心肌注射组bFGF、VEGF mRNA 表达与中药EPCs耳缘静脉注射组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，EPCs心肌注射组bFGF、VEGF mRNA 表达与EPCs耳缘静脉注射组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 各组术后2周不同心肌组织bFGF、VEGF mRNA 表达比较(±s)

2.2 各组缺血心肌及梗死心肌区bFGF、VEGF蛋白表达比较 在梗死心肌区及缺血心肌区，中药EPCs心肌注射组、中药EPCs耳缘静脉注射组bFGF、VEGF蛋白表达高于假手术组、模型组、EPCs心肌注射组、EPCs耳缘静脉注射组，差异均有统计学意义(P<0.05)，但中药EPCs心肌注射组bFGF、VEGF蛋白表达与中药EPCs耳缘静脉注射组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，EPCs心肌注射组bFGF、VEGF 蛋白表达与EPCs耳缘静脉注射组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，各组缺血心肌区bFGF、VEGF蛋白表达高于梗死心肌区。详见表2。

表2 各组术后2周不同心肌组织bFGF、VEGF蛋白表达比较(±s)

3 讨 论

AMI后心肌细胞大量坏死是预后不良的主要原因之一，长期以来，人们普遍认为，一旦心肌细胞死亡，几乎无再生能力，然而，越来越多的证据表明，即使在梗死区也存在具有修复和促进心肌再生作用的祖细胞，但在缺乏最佳氧气和营养物质的情况下，新生心肌细胞存活率很低[6]。大量基础研究及临床研究提示，在损伤组心肌区移植干细胞不仅能够分化产生有功能的新生心肌细胞，还可分化成内皮细胞分泌多种促血管生成分子，促进干细胞归巢，参与血管生成而改善损伤心肌血运重建并抑制心脏重塑过程，提示干细胞移植在未来辅助治疗AMI中的可行性[7]。

EPCs于1997年在人外周血液中被发现，是一种对缺血信号极为敏感的干细胞，能够在缺血早期迅速向缺血部位归巢，产生大量的血管生成细胞因子及促进原位细胞增殖，通过整合蛋白激酶B(Akt)通路、内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)传导、基质细胞衍生因子1等信号通路，并激活以及分泌VEGF在内的多种生长因子发挥保护和修复损伤组织的作用，如bFGF、VEGF等细胞生长因子，由于移植的EPCs面临着损伤组织低氧浓度、炎症反应等复杂环境，移植的EPCs在临床试验中的结果并不令人满意，通过EPCs预处理来保护EPCs活性可能是治疗缺血性心脏病有效的治疗策略，相关研究提示，逆转录病毒、慢病毒等介导的基因传递系统及使用两种细胞组合移植被证明具有明显提高细胞存活率和增强细胞功能，但天然化合物很容易从动物或植物分离，并且副作用更少，使之更具有优势，如褐藻和褐藻的提取物岩藻聚糖预处理EPCs能够明显减弱EPCs衰老和增强缺血组织的体内细胞增殖和细胞存活，雷公藤碱能促进EPCs迁移、增殖能力等[2，8-9]。

养心通脉方是我院全国名老中医李锡光教授治疗冠心病的常用方，其疗效肯定，沿用至今。本研究结果提示，养心通脉方预处理EPCs移植治疗能够明显增加AMI兔损伤心肌bFGF、VEGF表达，损伤心肌处移植与耳缘静脉注射移植两种干预方式并无明显差异。由于本研究样本量较小，干预时间短，缺少短期及远期疗效评价，仍需进行多基因、多蛋白、多通路的深入研究，同时进行远期疗效对比以及中药复方药理学交叉探讨其主要作用机制，以期为中医药预处理干细胞移植治疗AMI提供更为准确的研究证据。