响应面法优化超声波辅助提取小米多酚*

张春颖 李 楠*

（运城学院生命科学系，山西运城 044000）

小米（Setaria itatica），又称粟，是禾本科狗尾草属植物粟或谷子的种仁，是我国北方地区主要杂粮作物之一，居五谷之首。近年来多酚已经成为国内外学者研究的热点之一，有研究表明，小米中酚类化合物含量较高，种类较多，包括黄酮类、酚酸类、花色苷类等。酚类化合物可以清除体内自由基，具有较强的抗氧化活性以及预防与氧化应激有关的疾病等作用。

小米品种不同，多酚的种类及含量也不同。本文以沁州黄小米为原料，采用超声波辅助有机溶剂提取法，利用超声波的空化效应，使小米多酚与溶剂充分混合，在单因素试验的基础上，采用响应面法优化提取工艺，以期得到沁州黄小米多酚的最佳提取工艺，为沁州黄小米资源的进一步开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

沁州黄小米，山西省长治市武乡县。

没食子酸，国药集团化学试剂有限公司；Folin 试剂、石油醚、无水乙醇、无水碳酸钠，均匀分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-5500 紫外分光光度计，上海元析仪器有限公司；TDL6M型低速离心机，湖南湘立科学仪器有限公司；HH-4 数显恒温水浴锅，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；FA 1604 型电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；KQ-300GDV 超声波清洗器，上海梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理

小米除杂后，用粉碎机粉碎，过筛（50 目），然后用石油醚按料液比1∶2 脱脂处理72 h，干燥箱干燥，备用。

1.3.2 单因素试验

固定料液比1∶10，超声时间40 min，超声温度40 ℃，研究乙醇体积分数（50%、60%、70%、80%、90%） 对多酚得率的影响。

固定料液比1∶10，超声温度40 ℃，乙醇体积分数70%，研究超声时间（20 min、30 min、40 min、50 min、60 min） 对多酚得率的影响。

固定料液比1∶10，超声时间40 min，乙醇体积分数70%，研究超声温度（20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃） 对多酚得率的影响。

固定超声温度40 ℃，超声时间40 min，乙醇体积分数70%，研究料液比（1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14） 对多酚得率的影响。

1.3.3 响应面试验

根据单因素试验结果，利用Design Exper10.0软件Box-Benhnken 中心组合试验设计，以小米多酚得率为判定指标，3 个较为显著的因素为自变量设计因素水平表，见表1。

表1 响应面因素水平表

1.3.4 多酚含量测定

依次取0.1 mg/mL 没食子酸溶液0.0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL 于50 mL容量瓶中，加入3 mL Folin 试剂，25 mL 蒸馏水，静置5 min，加入9 mL10%的碳酸钠溶液后定容至刻度。避光反应30 min，以蒸馏水为空白对照，在760 nm 处测定吸光值。重复3 次测得出平均值，绘制多酚标准曲线。

准确量取5 mL 样液，按照上述方法测定吸光度值。根据标准曲线计算多酚含量。

2 结果与分析

2.1 多酚标准曲线

以没食子酸质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，见图1，标准曲线方程为：y=0.097 4x-0.012 1，相关系数R2=0.993 7。

图1 多酚标准曲线

2.2 单因素试验结果

2.2.1 乙醇体积分数对多酚得率的影响

乙酚体积分数对多酚得率影响结果见图2。

图2 乙醇体积分数对多酚得率的影响

由图2 可以看出，随着乙醇体积分数升高，多酚得率先升高后下降。乙醇体积分数不同，提取溶剂的极性不同，导致溶出的有效成分不同，乙醇体积分数为70%时，小米多酚得率最高。因此，选择乙醇体积分数70%较为适宜。

2.2.2 超声时间对多酚得率的影响超声时间对多酚得率的影响结果见图3。

图3 超声时间对多酚得率的影响

由图3 中可以看出，多酚得率随着提取时间的增加而升高，当提取时间超过40 min，多酚得率逐渐下降。原因是提取时间过短，提取不充分，导致得率偏低；提取时间越长，超声波产生的高速震动空化效应会破坏样液中的多酚类物质，使得率下降，并且提取时间过长，会使其他物质溶出较多，不利于后续纯化。因此选择超声时间40 min 较适宜。

2.2.3 超声温度对多酚得率的影响超声温度对多酚得率的影响结果见图4。

图4 超声温度对多酚得率的影响

由图4 可以看出，随着提取温度升高，多酚得率先增加后下降，当温度为40 ℃时，多酚得率最高。温度升高可以提高物质的溶解度，然而温度过高可能导致小米中多酚物质被热分解，破坏已经提取出的多酚结构，使多酚得率下降。因此，选择超声提取温度40 ℃为宜。

2.2.4 料液比对多酚得率的影响

料液比对多酚得率影响结果见图5。

图5 料液比对多酚得率的影响

由图5 可知，随着提取溶剂体积的增加，多酚得率先升高后趁于平稳。当料液比超过1∶10 后，得率呈现稳定趋势。料液比达到一定程度时，多酚基本溶出，继续增加料液比会造成原材料浪费和经济损失。因此，选择料液比1∶10 为宜。

2.3 响应面试验结果

2.3.1 回归模型的建立及方差分析

根据单因素试验结果，从中选取了3 个对得率影响显著的因素进行3 水平3 因素响应面试验，试验结果见表2。以多酚得率为响应值，得到二次回归模型为： Y=73.83 ＋3.29A ＋0.68B－2.17C ＋1.70AB－3.84AC－0.36BC－11.91A2－7.78B2－7.58C2，其中A 为乙醇体积分数，B 为超声时间，C为超声温度。

表2 响应面试验设计与结果

表3 方差分析表

3 结论

通过单因素和响应面优化试验，得出超声波辅助提取沁州黄小米多酚的最佳工艺条件为：乙醇体积分数72%，超声时间41 min，超声温度38 ℃，在此工艺条件下多酚得率预测值为74.34 mg/100g，验证试验结果为74.34 mg/100g，接近预测值。说明该模型可以有效预测沁州黄小米多酚的超声波提取工艺参数，为沁州黄小米多酚的提取及综合利用提供一定的理论参考。

对模型进行方差分析，结果见表3。该模型极显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P=0.122 7），说明该模型具有统计学意义，能较好的预测小米多酚的得率。其决定系数RAdj2=0.958 6，说明该模型相关性较好。一次项A（乙醇体积分数），交互作用项AC，二次项A2、B2、C2对多酚得率影响极显著（P＜0.01），一次项C（超声温度） 对多酚得率影响显著（P＜0.05），其余因素影响不显著。各个因素对多酚得率影响的主次顺序为乙醇体积分数＞超声温度＞超声时间。

2.3.2 等高线图及响应曲面图分析

图6、图7～8 见下页分别为各个因素交互作用与响应值之间的等高线及响应曲面图。由等高线图可以看出，AC 交互作用的等高线最接近椭圆，响应曲面最陡，所以AC 交互作用对得率的影响最显著；BC 交互作用的等高线接近圆形，相应曲面较平，说明BC 交互作用对得率的影响较小。

2.3.3 提取工艺优化及验证试验

结合回归方程和响应面结果分析，超声波辅助法提取小米多酚的最优工艺条件为：乙醇体积分数71.727%，超声时间40.671 min，超声温度38.117 ℃，此时得率为74.34 mg/100g。考虑到实际操作，将工艺条件调整为乙醇体积分数72%，超声时间41 min，超声温度38 ℃，进行3 次平行试验，多酚得率平均值为74.13 mg/100g，与理论值基本吻合，说明该模型能较好的预测小米多酚得率。

图6 超声时间和乙醇体积分数对多酚得率的影响

图7 超声温度和乙醇体积分数对多酚得率的影响

图8 超声温度和超声时间对多酚得率的影响