24-表油菜素内酯对亚低温胁迫下番茄幼苗生长与钾积累的影响

杨 莲 高 欢 吴凤芝

（东北农业大学园艺园林学院，黑龙江哈尔滨 150030）

番茄（Solanum lycopersicum）喜温，生长最适宜温度为20～30 ℃，对低温敏感，是典型的冷敏感植物（郭文英，2006）。在我国北方地区设施番茄节能栽培中，由于日光温室设施结构比较简陋以及加温设备不完善，冬春季节常遭遇昼/夜温度低于20/12 ℃的亚低温胁迫（白龙强 等，2016）。短期亚低温对植物生长影响较小，但实际冬春反季节栽培中蔬菜常遭遇长期亚低温胁迫，导致生长发育不良、落花落果，严重影响品质和产量（李建明 等，2016）。亚低温环境下植物各种代谢活动受阻（李俊 等，2012），抑制植株生长，根系生长不良，根系活力降低从而导致养分吸收量减少（刘玉凤 等，2017）。光合作用对低温胁迫非常敏感（刘春英 等，2012；Liu et al.，2016），低温导致叶绿素降解，光合机构遭到破坏，最终导致光合能力下降（Abram et al.，2007；武威 等，2014）。钾是植物光合作用过程中不可或缺的重要元素之一，能活化光合作用关键酶的活性，促进光合作用，提高植物的抗寒性（潘瑞炽，2004）。温度影响植株根部对K+的吸收（Bravo & Uribe，1981；Siddiqi et al.，1984）以及K+在各器官中的分配（Yan et al.，2012），有研究表明亚低温降低了番茄幼苗各器官的K+含量（徐菲 等，2013）。

近年来有关外源物质缓解亚低温胁迫的研究大多集中在光合与抗氧化等生理指标上，例如，亚低温胁迫下外源赤霉素（GA）通过提高光系统Ⅱ的光化学活性，增强CO2同化能力，促进黄瓜幼苗生长（白龙强 等，2016）。亚适宜温度下外源施用叶绿酸铁可以促进渗透调节物质积累，降低丙二醛（MDA）含量，从而减轻黄瓜受到的亚低温伤害（张蒙 等，2014）。外源喷施硝酸钙能显著缓解夜间亚低温对薄皮甜瓜生长的抑制作用，提高保护酶活性，降低活性氧产生速率，增强甜瓜植株的抗寒性（李天来 等，2011）。

24-表油菜素内酯（EBR）又称芸苔素内酯，是一种新型甾醇类植物激素，广泛存在于植物界，参与植物生理代谢和生长发育过程，被称为第六大植物激素（Divi & Krishna，2009）。EBR 还在植物抵御弱光（李蒙 等，2019）、高温（吴雪霞 等，2013）和低温（李淑叶 等，2018）等非生物胁迫中发挥重要作用。前人研究发现，EBR 在缓解低温胁迫上有很好的作用。EBR 通过调节碳同化和抗氧化代谢，增强了番茄（束胜 等，2016）、黄瓜（吴秀和陆晓民，2015）对亚低温胁迫的耐受性。有关亚低温条件下EBR 对番茄钾吸收以及相关基因表达的影响鲜有研究。本试验以2 个耐寒性不同的番茄品种为试验材料，研究亚低温胁迫下外源EBR对番茄生长和钾吸收的影响，以期为冬春季设施番茄栽培中24-表油菜素内酯的施用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2018 年3—5 有在东北农业大学园艺设施工程中心节能日光温室和园艺园林学院蔬菜生理生态研究室（45°41′N，126°37′E）进行。供试番茄品种为低温敏感型品种东农708（DN 708）和耐低温型品种东农722（DN 722），由东北农业大学番茄研究所提供。番茄种子经消毒、浸种后于28 ℃培养箱中催芽，70%种子露白后播于育苗盘中，待幼苗两叶一心时分苗于装有基质（蛭石∶珍珠岩=2V∶1V）的营养钵中，每钵1 株，每3 d 浇灌1次半剂量改良的Hogland 营养液，每钵浇100 mL。

1.2 试验方法

采用盆栽试验，番茄幼苗长至四叶一心时，挑选整齐一致的幼苗放入温度25 ℃/18 ℃（昼/夜）、光照强度12 000 lx、光周期16 h/8 h（昼/夜）、相对湿度60%的人工气候箱中适应2 d 后进行处理。试验以适温25 ℃/ 18 ℃（昼/夜）为对照，亚低温处理温度为15 ℃/10 ℃（昼/夜），2 个番茄品种各设3 个处理：对照、亚低温处理、亚低温下施用24-表油菜素内酯处理（外源EBR 处理）。每个处理30 株，3 次重复，外源EBR 处理的植株每天20：00 叶面喷施浓度为0.1 μmol·L-1的EBR（叶片正面和背面均附着水珠为止），对照和亚低温处理的植株喷施等量蒸馏水，喷施10 d 后进行取样。

1.3 项目测定

1.3.1 株高与干质量的测定 每个处理随机选取6株幼苗，洗净后吸干水，用直尺测量株高；然后置于105 ℃烘箱内杀青30 min，65 ℃烘干至恒重，用电子天平称量干质量。

1.3.2 丙二醛含量、电解质渗透率和光系统Ⅱ最大光化学效率的测定 丙二醛（MDA）含量测定采用硫代巴比妥酸法（王学奎和黄见良，2015）；电解质渗透率测定参照Ishitani 等（1998）的方法略有改动；光系统Ⅱ最大光化学效率（Fv/Fm）测定参考杨万基等（2017）的方法。

1.3.3 K+浓度的测定 植株各部分样品烘干后粉碎，过0.3 mm 筛，用浓H2SO4消煮，然后采用火焰光度法测定植株根、茎、叶中K+浓度。

1.3.4 K+通道蛋白和转运蛋白基因表达的测定用Trizol 试剂提取番茄叶片与根系总RNA。质量合格的RNA 采用BioTeke（百泰克生物技术有限公司）的反转录试剂盒合成cDNA。用Primer 5.0软件设计基因特异引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以番茄actin基因（Lovdal & Lillo，2009）为内参基因，在实时荧光定量PCR 仪上进行qRT-PCR 反应。定量检测反应体系为20 μL，反应条件为95 ℃ 3 min；95℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40 个循环。每个样品3 次重复，基因表达水平采用2-ΔΔct法进行计算。

表1 qRT-PCR 基因特异性引物

1.4 数据分析

采用Microsoft Excel 软件处理原始数据，利用SPSS 软件进行统计分析，方差分析采用Tukey’s HSD 在P＜0.05 水平下进行分析。

2 结果与分析

2.1 外源EBR 对亚低温胁迫下番茄幼苗生长的影响

由图1 可知，亚低温处理显著降低了2 个番茄品种幼苗的株高与干质量，与对照相比，低温敏感型番茄品种DN 708 的株高与干质量分别降低了50.40%和19.87%，降幅大于耐低温型番茄品种DN 722（44.52%和17.71%）。与亚低温处理相比，外源EBR 处理显著提高了2 个番茄品种幼苗的株高与干质量，DN 708 的株高与干质量分别增加了31.87%和13.31%，增幅大于DN 722（15.58%和9.98%）。2 个品种间进行比较，DN 722 亚低温处理与外源EBR 处理的干质量均显著高于DN 708。

2.2 外源EBR 对亚低温胁迫下番茄幼苗MDA 含量、电解质渗漏率与光系统Ⅱ最大光化学效率的影响

如图2 所示，与对照相比，亚低温处理的2 个番茄品种幼苗叶片MDA 含量和电解质渗漏率显著提高，光系统Ⅱ最大光化学效率（Fv/Fm）显著降低，DN 708 的变化幅度高于DN 722。与亚低温处理相比，外源EBR 处理显著降低了2 个番茄品种幼苗MDA 含量和电解质渗漏率，显著提高了Fv/Fm，其中DN 708 幼苗的MDA 含量和电解质渗漏率分别降低了22.85%和28.32%，Fv/Fm提高了24.36%，变化幅度高于DN 722（18.58%，22.99%和17.11%）。表明亚低温胁迫下叶面喷施EBR 溶液对DN 708 植株冷损伤的缓解效果大于DN 722。

2.3 外源EBR 对亚低温胁迫下番茄各器官K+浓度的影响

由表2 可知，亚低温胁迫下2 个番茄品种根中K+浓度显著增加，茎和叶中显著减少，DN 708茎和叶中K+浓度显著低于DN 722。与对照相比，DN 708 根中K+浓度增加54.71%，茎和叶中分别减少16.75%和30.28%；DN 722 根中K+浓度增加64.11%，茎和叶中分别减少12.00%和18.14%。与亚低温处理相比，外源EBR 处理显著增加了2 个番茄品种各器官K+浓度，DN 708 根、茎和叶中K+浓度分别增加16.84%、6.59%和15.17%，DN 722分别增加12.87%、6.33%和11.29%，DN 708 的增加幅度大于DN 722。

表2 外源EBR 对亚低温胁迫下番茄各器官K+浓度的影响 mg·g-1

2.4 外源EBR 对亚低温胁迫下番茄幼苗钾素吸收转运相关基因表达的影响

2.4.1 外源EBR 对亚低温胁迫下番茄幼苗K+通道蛋白基因LKT1相对表达量的影响 如图3 所示，与对照相比，亚低温处理显著提高了DN 708 和DN 722 根中LKT1基因的相对表达量（图3-a），显著降低了叶中LKT1基因的相对表达量（图3-b）；2 个品种间进行比较，DN 708 叶中LKT1基因的相对表达量显著低于DN 722。与亚低温处理相比，外源EBR 处理显著提高了2 个番茄品种根和叶中LKT1基因的表达，DN 708 根和叶中LKT1基因的相对表达量分别提高了70.94%和110.83%，增幅大于DN 722（66.78%和94.85%），由此可见，亚低温胁迫下叶面喷施EBR 溶液对DN 708 植株中LKT1基因相对表达的促进作用更大。

2.4.2 外源EBR 对亚低温胁迫下番茄幼苗K+转运蛋白基因SIHAK5相对表达量的影响 由图4可以看出，亚低温处理下DN 708 和DN 722 根中SIHAK5基因的相对表达量显著高于对照（图4-a），叶中SIHAK5基因的相对表达量显著低于对照（图4-b）。与亚低温处理相比，外源EBR 处理的2 个番茄品种根和叶中SIHAK5基因的相对表达量均显著增加，根中分别增加了110.50%和88.43%；叶中分别增加了161.76%和144.04%，DN 708 的增加幅度大于DN 722。2 个品种间进行比较，DN 722 亚低温处理与外源EBR 处理的番茄叶片中SIHAK5基因的相对表达量均显著高于DN 708。

2.4.3 外源EBR 对亚低温胁迫下番茄幼苗K+转运蛋白基因SIHAK9相对表达量的影响 由图5 可知，与对照相比，亚低温处理显著增加了DN 708和DN 722 根中SIHAK9基因的相对表达量（图5-a），显著降低了叶中SIHAK9基因的相对表达量（图5-b）。与亚低温处理相比，外源EBR 处理显著提高了2 个番茄品种根和叶中SIHAK9基因的相对表达量，DN 708 根和叶中SIHAK9基因的相对表达量分别增加了68.90%和474.31%，增幅大于DN 722（44.45%和176.34%）。

3 讨论与结论

番茄是冷敏感作物，当温度低于15 ℃就会导致其生长发育不良（朱龙英 等，1998）。干物质是植物体内的有机物在充分干燥后的质量，是衡量植物营养成分的一个重要指标，植物干物质的积累涉及植株生长、光合作用的能力及同化产物运输等一系列的生理生化过程（李俊，2013）。本试验结果表明，亚低温胁迫下2 个番茄品种幼苗株高和干质量显著下降，其中DN 708 的下降幅度大于DN 722，表明低温敏感型番茄品种东农708 生长受抑制的程度明显高于耐低温型番茄品种东农722，与高欢等（2018）的研究结果一致。24-表油菜素内酯（EBR）是一种有效的激素类物质，在植物体内广泛分布，其含量的微小变化都会对植物的生长发育产生较大的影响（李程 等，2015）。本试验中，叶面喷施EBR 溶液能有效缓解亚低温胁迫下2 个番茄品种幼苗株高和干质量的下降，并且EBR对亚低温胁迫下DN 708 株高的缓解效果大于DN 722，这可能是由于不同番茄品种对EBR 的适应性不同。

植物膜系统是植物遭受冷害的最敏感部位，低温胁迫环境下植物细胞膜被破坏，膜透性增大，导致细胞内的电解质外渗，细胞电导率增大（李淑叶等，2018），同时，活性氧产生和清除的平衡被破坏，叶片发生膜脂过氧化作用，导致MDA 含量增加（李淑叶 等，2010）。本试验结果表明，亚低温胁迫下2 个番茄品种幼苗的MDA 含量和电解质渗透率显著升高，其中DN 708 的增幅大于DN 722，表明DN 708 膜损伤更严重；而外源喷施EBR 显著降低了2 个番茄品种幼苗叶片MDA 含量和电解质渗透率，且DN 708 的降低幅度较大，说明EBR能减轻亚低温胁迫下番茄叶片膜脂过氧化程度，缓解细胞膜损伤，增强番茄植株在亚低温胁迫下的抗性，这与孙玉珺等（2019）在玉米上的研究结果一致。植物的生长离不开光合作用，低温可直接影响植物光合器官的结构和功能，从而影响光合作用（Smillie & Hetherington，1984）。Fv/Fm是 反 映 光系统Ⅱ活性的重要指标，能够表征植物受到的光抑制程度（周建 等，2009）。低温弱光胁迫条件下西葫芦Fv/Fm降低，光合作用受抑制，但耐低温弱光性强的品种Fv/Fm高于其他品种（刘栓桃 等，2009），本试验结果与之相似，亚低温胁迫下DN 722 的Fv/Fm显著大于DN 708，说明其在低温下仍能保持较高的光合效率，且外源喷施EBR 能显著提高2 个番茄品种植株的Fv/Fm，表明EBR 可以通过缓解番茄受到的光抑制，维持光合作用的正常进行，有助于番茄植株生长。

钾是植物必需的营养元素，在酶激活、蛋白质合成、渗透调节、光合作用、气孔运动、能量转移、阳离子-阴离子平衡和抗逆性等方面发挥着重要作用（Marschner，2012）。组织中高浓度的K+有助于提高植株的抗逆性（Wang et al.，2013），有研究表明在冬季番茄设施栽培过程中施用钾肥，能增强番茄植株耐寒性，帮助植株越冬，从而提高番茄产量（郭熙盛 等，1999）。本试验发现，亚低温条件下2 个番茄品种幼苗根中K+浓度显著升高，与任志雨等（2003）在黄瓜上的研究结果一致，这可能是番茄的自我保护机制，亚低温胁迫下番茄根系从土壤中吸收更多的钾来抵御逆境；茎和叶中K+浓度显著降低，可能是由于亚低温抑制了K+从地下部向地上部器官转运，2 个品种的根中K+浓度无显著差异，而茎和叶中的K+浓度DN 722 显著高于DN 708，这可能是由于亚低温胁迫下耐低温型番茄的K+迁移能力大于低温敏感型番茄，叶片中积累更多K+来抵御亚低温逆境。而外源喷施EBR显著增加了番茄幼苗根、茎和叶中K+浓度，K+浓度的增加有利于植物光合同化产物的积累（Waraich et al.，2011），表明外源EBR 处理的番茄植株中更高浓度的K+有利于番茄植株的生长。

植物体内K+吸收和转运主要依靠K+通道与K+转运蛋白，番茄中的K+通道基因LKT1是内流型K+通道基因，与拟南芥AKT1基因高度同源。研究表明低钾胁迫下，提高拟南芥AKT1 通道蛋白活性，能增强拟南芥K+吸收能力（Xu et al.，2006）。植物体内的K+转运蛋白不仅在植物K+吸收转运过程中发挥重要作用，还参与植物对环境胁迫的响应。KT/HAK/KUP 家族是重要的K+转运蛋白家族（Ahn et al.，2004），拟南芥HAK5基因主要在植株从外界吸K+过程中发挥重要作用（Pyo et al.，2010），AtHKT1、HAK6以 及HAK11参与植物对盐胁迫的响应，从而增强植物的抗盐性（Maathuis，2006）。SIHAK5、SIHAK9属 于 番 茄KT/HAK/KUP 家族中的K+转运体，其中SIHAK9在番茄的根部与幼叶中均有较高的表达量，在植株生长发育、矿质营养平衡与胁迫适应的过程中均起到重要的作用（Hyun et al.，2014）。本试验研究发现，亚低温胁迫诱导了K+通道基因LKT1、K+转运基因SIHAK5、SIHAK9在2 个番茄品种根中的表达，但抑制了在叶中的表达，这一结果表明，亚低温胁迫下番茄幼苗可能通过提高根系中K+吸收转运相关基因的表达，促进根系从土壤中吸收K+，从而增加了根系中K+浓度，增强植株耐冷性；同时抑制了K+向叶片中的转运，从而导致叶片中的K+含量下降。亚低温胁迫下外源EBR 处理提高了2 个番茄品种根与叶中LKT1和SIHAK5基因的表达，这可能是各器官中K+浓度增加的主要原因，但是亚低温胁迫下外源EBR 如何调节番茄钾吸收转运机制还有待进一步研究。

综上所述，亚低温条件下外源24-表油菜素内酯（EBR）可通过缓解植物膜损伤，减轻膜脂过氧化程度，促进K+吸收和转运相关基因的表达，增加番茄各器官中K+浓度来提高番茄幼苗对亚低温胁迫的耐受性，但耐冷性不同的番茄品种对EBR的适应性存在差异，EBR 对低温敏感型番茄品种东农708 的作用效果大于耐低温型番茄品种东农722。