基于GEO数据库探究RACGAP1表达与膀胱癌患者临床病理和预后的关系

张文杰 熊巧华 陈思超 朱家永 张冉 翁鸿 曾宪涛

膀胱癌是全球第十二位常见的恶性肿瘤，同时也是泌尿系统第一常见的恶性肿瘤[1]。在我国，膀胱癌是男性泌尿生殖系统发病率第二高的肿瘤，居男性恶性肿瘤第七位，近年来随着我国人口结构与生活习惯的变化，膀胱癌的发病率也不断升高[2]。目前治疗非肌层浸润性膀胱癌的主要手段是行经尿道膀胱肿瘤电切术辅以术后辅助治疗，肌层浸润性膀胱癌主要是行根治性膀胱切除术。术后辅助治疗主要包括化疗和免疫治疗[3]，不良反应均较多，且高危患者术后前2年每3个月需行1次膀胱镜检查，增加了患者痛苦及经济负担。因此，膀胱癌的标志物和潜在靶点研究极为重要。

Ras同源物家族鸟苷三磷酸(GTP)酶是一组分子量为20～25 kD的小分子GTP结合蛋白，具有GTP酶的活性，以及调节细胞增殖、存活、运动、黏附及分化等多种细胞功能[4]。Rac GTP酶活性蛋白1(Rac GTPase activating protein 1, RACGAP1)是GTP酶活性蛋白家族的一员，其基因位于染色体12q13内，可调节细胞周期、胞质分裂、细胞分化及信号转导，作为细胞增殖的标志物在细胞分裂、增殖的过程中起重要作用[4-6]。近年来对RACGAP1在肿瘤相关领域研究的报道不断增多，该基因现已被证实与多种肿瘤的发生、发展密切相关，如乳腺癌[7]、胃癌[8]、前列腺癌[9]等。但极少有关于RACGAP1表达与膀胱癌临床病理参数及预后关系方面的报道。有鉴于此，本研究经筛选后选取基因表达汇编(Gene Expression Omnibus, GEO)数据库中膀胱癌在线数据集，对数据进行标准化处理，并对RACGAP1表达与膀胱癌患者临床病理和预后的关系展开研究，进一步探究其对膀胱癌的可能作用机制。

对象与方法

一、一般资料

从NCBI的GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下载表达谱数据集GSE13507(非配对样本，其中原发性膀胱癌165例、正常组织样本68例，均为韩国人群数据)，并进行标准化处理。采用Illumina公司的人类表达芯片(Illumina human-6 v2.0 expression beadchip)GPL6102对GSE13507进行注释(RACGAP1基因对应的探针为ILMN_1702140)。同时下载临床病理数据集，包含165例原发性膀胱癌患者的性别、年龄、肿瘤侵袭性、T分期、N分期、M分期、分级(WHO 2004分级法)及复发进展情况。165例膀胱癌患者的一般资料见表1。

二、统计学分析

采用SPSS 20.0统计学软件对数据进行统计学分析。对正常组织与膀胱癌组织中RACGAP1表达水平行t检验，分析其差异性。同时为探究RACGAP1表达水平与临床病理特征和复发进展的关系，行卡方检验。去除临床信息缺失的样本后，进行预后分析。依据基因表达谱的数据，将数据集GSE13507中的165例原发性膀胱癌患者样本按RACGAP1的表达量由低到高排序，以中位值为界值将样本分为低表达组(<中位值)和高表达组(≥中位值)。对RACGAP1表达与临床病理特征进行单因素、多因素Logistic回归分析，分析RACGAP1表达的危险因素。采用Kaplan-Meier法行Log-rank检验进行生存分析，以P<0.05为差异有统计学意义。使用GSEA 3.0版本对样本数据集GSE13507中的膀胱癌组织样本进行基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis， GSEA) 。选取GSEA网站msigdb数据库中内置的hallmark gene sets数据集(http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)为参照基因集，对该样本数据集按照默认加权富集统计的方法进行分析，每次分析重复1 000次。以P<0.05及错误发现率<0.05的基因集作为显著富集基因集。

结 果

一、RACGAP1的表达情况

对样本数据集GSE13507中的基因表达数据进行分析，结果显示正常膀胱组织中RACGAP1水平为7.557±0.020，低于膀胱癌组织(7.790±0.028)，两者差异有统计学意义(P<0.05)；膀胱癌组织中RACGAP1水平的中位值为7.700，以此为界值分组，165例膀胱癌患者中82例为低表达组，83例为高表达组。

二、RACGAP1表达与膀胱癌临床病理参数的关系

在膀胱癌样本数据集GSE13507中，卡方检验结果显示膀胱癌组织中RACGAP1表达水平与患者性别、肿瘤M分期和进展无关(P>0.05)，但与患者年龄、肿瘤侵袭性、T分期、N分期、分级和复发有关(P<0.05)，见表1。单因素、多因素Logistic回归分析结果表明，患者年龄及肿瘤分级为RACGAP1表达的危险因素，见表2。RACGAP1低表达患者的平均年龄为(61.87±13.14)岁，RACGAP1高表达患者的平均年龄为(68.46±9.71)岁，两者差异有统计学意义(P<0.001)。

表1 RACGAP1表达水平与膀胱癌临床病理特征的关系

表2 RACGAP1表达的危险因素

三、RACGAP1与膀胱癌预后的关系

生存分析结果显示在膀胱癌样本数据集GSE13507中，RACGAP1高表达组和低表达组的5年总生存率分别为56.6%和73.9%(HR=0.473 1，95%CI：0.291 2～0.768 8，P=0.002 5)，5年肿瘤特异性生存率分别为70.9%和91.6%(HR=0.334 6，95%CI：0.166 4～0.672 9，P=0.000 5)，5年无复发生存率分别为76.7%和85.9%(HR=0.470 4，95%CI：0.224 4～0.986 0，P=0.045 8)，RACGAP1低表达组的预后生存显著优于高表达组，两者差异有统计学意义。见图1。

A：总生存率；B：肿瘤特异性生存率；C：无复发生存率图1 膀胱癌组织中RACGAP1不同表达水平的生存曲线

四、RACGAP1高表达组的GSEA分析

为进一步研究膀胱癌样本数据集GSE13507中RACGAP1可能的作用机制，对RACGAP1表达水平与各种生物通路基因集的富集关系进行了分析，结果显示RACGAP1高表达样本富集了MYC信号通路、精子发生、未折叠蛋白反应、G2M检查点、E2F转录因子、MTORC1信号、有丝分裂纺锤体、PI3K/AKT/mTOR途径和DNA修复相关的基因集。提示RACGAP1可能通过上述信号通路参与膀胱癌的发生、发展。见表3。

表3 RACGAP1高表达的膀胱癌样本GSEA分析

讨 论

RACGAP1通过调节GTP酶活性，在调节细胞周期、细胞分化、细胞迁移和新陈代谢等生命活动中起重要的作用[6-9]。RACGAP1在细胞分裂间期位于细胞核内，与Rac1相互作用，并参与激活NADPH氧化酶，影响分裂期的物质合成准备[10-13]。细胞分裂中期，RACGAP1与微管骨架绑定迁移到有丝分裂纺锤体，作为支架蛋白因子参与细胞分裂[13]。RACGAP1在细胞分裂后期和末期移位至中央区，后在胞质分裂期浓缩至中间体[13-14]。

研究显示在人体细胞中RACGAP1与KIF23相互作用，共同促进中央纺锤体蛋白复合体的形成，进而调节胞质分裂过程[10-11]。此外RACGAP1也与多条炎性通道有关，对组织细胞造成损伤[13]。RACGAP1连同ANLN、ECT2、AURKB8、PRC1和KIF23(MKLP1)这些胞质分裂相关的群集基因，共同调控细胞增殖分化[10-11]。RACGAP1可以通过调节GTP-Rac1的水平来调节Rac1、RhoA和Erk蛋白的活化，活化的Rac1、RhoA和Erk蛋白在调节肿瘤细胞迁移和侵袭中起重要作用[9,15]。

RACGAP1高表达癌组织中Rac和cdc42的活性更高，组织细胞骨架重构，细胞形态改变，癌组织与周围正常组织的黏附降低，癌细胞更易发生转移[10]。RACGAP1也可作用于AURKB酶，通过使其第387位的丝氨酸发生磷酸化，致使它的GTP酶作用方向从激活Rac蛋白活性转向为激活Rho，进而导致Rac GTP的增多和Rho GTP的减少，以及上皮间质转化[16]。有报道称RACGAP1可通过调节群集基因，引发纺锤体的组装并触发分裂沟内移，是决定胞质分裂能否完成的重要步骤[17]。此外RACGAP1上调表达的Rac和cdc42，可以增强癌细胞的耐药性[18]。RACGAP1过表达会导致有丝分裂过程出错，引起细胞周期紊乱，通过调节GTP酶的活性影响细胞代谢，引起异常的胞质分裂，导致细胞的恶性转化。在临床实践中，由于RACGAP1在正常组织细胞中表达沉默，Rac1处于失活状态，而在肿瘤细胞中过表达时才激活Rac1，RACGAP1抑制剂对正常组织细胞是没有作用的[10]，RACGAP1可作为肿瘤潜在的免疫治疗靶点，解决化疗药物耐受的问题，为膀胱癌的治疗提供新思路[18]。

本研究利用生物信息学的方法探究RACGAP1与膀胱癌的关系，通过对GEO数据库中膀胱癌样本数据集GSE13507(165例膀胱癌样本)的数据分析，发现RACGAP1在膀胱癌组织中的表达显著高于正常膀胱组织；RACGAP1的表达与膀胱癌患者的年龄、肿瘤侵袭性、T分期、N分期、肿瘤分级和复发等临床病理特征在统计学上具有相关性；生存分析结果显示RACGAP1高表达的患者术后总生存期更短，且肿瘤进展更易发生；GSEA分析提示RACGAP1高表达的膀胱癌组织具有分裂增殖的潜能，能激活MYC、E2F和MTORC1等肿瘤相关信号通路，作用于PI3K/AKT/mTOR途径，调控细胞有丝分裂的过程，阻滞对损伤DNA的修复，在膀胱癌的发生、发展过程中发挥重要作用。

Martini等[19]分析了RACGAP1在108例膀胱癌患者组织中的表达，结果显示RACGAP1表达与肿瘤分期相关，与肿瘤分级、淋巴结侵犯、转移、复发、生存等无相关性。这可能与选取的研究对象有关，本研究群体是亚洲人群，Martini等研究的群体为高加索人群；此外，还可能与样本量、实验检测等其他因素有关。

本研究尚存在以下不足：首先,本研究采用的是公共数据库进行的数据分析，未采用免疫组化等实验方法开展样本验证；其次，我们在TCGA数据库中未能发现RACGAP1与膀胱癌预后有关。因此，本研究结果尚需进一步开展相关研究加以验证。