p21 激活酶2 在膀胱癌组织中的表达及对癌细胞活性的影响

赵伟

（新疆维吾尔自治区人民医院 新疆 乌鲁木齐 830000）

膀胱癌是临床中最为常见的一种泌尿系统恶性肿瘤，具有较高的发病率和病死率，严重危害人们健康[1]。p21 激活酶2（PAK2）是PAK 家族重要成员，PAK 家族在转录因子调控、细胞生长、细胞分裂凋亡等过程中起到了重要作用[2]。通过免疫组织化学法对膀胱癌组织及癌旁组织中PAK2 表达情况进行了检测，旨在分析其与临床病理特征的关系，及其对癌细胞活性的影响。

1.资料与方法

1.1 一般资料

选取医院2018 年1 月—2020 年4 月接受手术治疗的膀胱癌患者68 例，均为尿路上皮癌。手术切除患者膀胱癌组织及癌旁组织分别作为膀胱癌组和癌旁组。详细收集患者的一般资料，主要包括年龄、性别、TNM 分期、组织分化程度、有无淋巴结转移等。68 例患者中，男性47 例，女性21 例；年龄52 ～78 岁，平均年龄（62.09±5.46）岁。

1.2 方法

1.2.1 PAK2 阳性率检测 通过免疫组织化学法检测膀胱癌组织和癌旁组织PAK2 阳性率，取甲醛溶液固定膀胱癌组织和癌旁组织，开展石蜡包埋和连续切片（厚度4mm），再实施常规二甲苯脱蜡和梯度酒精脱水处理，用3%过氧化氢封闭处理内源性过氧化物酶，并对标本实施常规脱蜡，再开展微波抗原修复，于10%山羊血清封闭组织内加入非特异性抗原开展操作，并加入适量兔抗人ER 和PR 抗体，抗体均购自南京福麦斯生物科技有限公司，在4℃的冰箱内孵育24h，用PBS 缓冲溶液替代一抗作阴性对照；同时，于次日滴加适量的羊抗兔二抗（PAK2 蛋白二抗均经生物素标记），实施SP（免疫组化）染色及DAB 显色，用苏木素实施复染，选择中性树脂封片，于显微镜下观察，将已知的膀胱癌阳性切片视作阳性对照。于400 倍显微镜下随机选取视野5 个，观察视野内阳性细胞计数、总细胞计数，通过半定量积分法实施结果判定：①按每张切片内细胞染色强度进行评分，无显色计0 分，浅黄色染色计1 分，棕黄色染色计2 分，棕褐色染色计3 分。②按组织切片内阳性染色细胞数和总肿瘤细胞数的比值实施评分，若0 分：比值≤5%，1 分：＞5%～25%，2分：＞25%～50%，3 分：＞50%～75%，4 分：比值＞75%。将上述两项评分相乘获取总评分，总评分为0 分代表阴性（-），1 ～12 分代表阳性。

1.2.2 Transwell 实验测定细胞迁移和侵袭能力 于低温条件下将无血清培养基调制为1mg/ml 的Matrigel 胶溶液，均匀铺于上室，每室为20μl，保存于温箱中。向下室加入500μl甘油10%胎牛血清的RPMI1640 培养基，用无牛清培养基将转染CD511B 或者PAK2 质粒的T24 细胞配制成为5×105/ml 细胞悬液，然后均匀覆盖于胶上，每室约200μl，放置于二氧化碳体积分数为5%的培养箱，温度控制在37℃，时间为24h。将室内液体倾去，再放置于4%多聚甲醛溶液中固定30min，温度为室温，在风干之后取2%结晶紫进行染色，时间为30min，将聚碳脂膜内侧面的细胞擦去，于显微镜下对外侧面细胞进行观察，随机选取5 个高倍镜视野，对穿膜细胞数进行计数，每组各3 个复孔。迁移实验同上，无需放置Matrigel 胶，在细胞接种20h 之后进行固定及染色，同样各3 个复孔。

1.3 统计学处理

采用SPSS20.0 统计软件对数据进行处理，计量资料应用均数±标准差（±s），采用t检验；计数资料以百分数（%）表示，采用χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 膀胱癌组及癌旁组PAK2 表达水平比较

膀胱癌组PAK2 阳性41 例（60.29%），显著高于癌旁组的12 例（17.65%），差异有统计学意义（χ2=26.000，P＜0.05）。见图1。

图1 A：PAK2 在膀胱癌组织中的阴性表达；B：PAK2 在癌旁组织中的阳性表达（×400）

2.2 膀胱癌患者临床病理特征与PAK2 表达的关系

PAK2 在膀胱癌组织中的表达与年龄、性别、肿瘤直径无关（P＞0.05），与TNM 分期、组织分化程度、淋巴结转移相关（P＜0.05），见表1。

表1 膀胱癌患者临床病理特征与PAK2 表达的关系[n（%）]

2.3 过表达PAK2 对癌细胞迁移和侵袭能力的影响

过表达MTA2 稳转T24 细胞侵袭以及迁移数目均显著高于CD511B 稳转，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 过表达PAK2 对癌细胞迁移和侵袭能力的影响（±s）

表2 过表达PAK2 对癌细胞迁移和侵袭能力的影响（±s）

组别 侵袭数目 迁移数目CD511B 稳转 30.89±4.06 32.00±2.09 MTA2 稳转 51.94±4.15 65.00±6.72 t 6.280 8.122 P 0.000 0.000

3.讨论

临床中，大多数恶性肿瘤患者死亡的主要原因为病灶转移及侵袭，因而了解癌细胞侵袭及转移机制具有重要意义[3]。近年来，随着分子检测手段的不断发展进步，恶性肿瘤相关基因表达情况已经成为临床研究的一个热点。PAK2 广泛存在机体各组织器官中，PAK2 具有独特的作用，可以通过活化细胞外调节激酶加快细胞生长，还可以在细胞凋亡信号作用下引起细胞凋亡[4]。

众多研究显示，在甲状腺癌、结肠癌、宫颈癌以及乳腺癌等恶性肿瘤中PAK2 均呈高表达，与恶性肿瘤的发生及发展密切相关[5-6]。本结果显示，膀胱癌组PAK2 阳性率显著高于癌旁组，且与TNM 分期、组织分化程度、淋巴结转移相关，说明PAK2 可以在一定程度上反映膀胱癌患者TNM 分期、组织分化程度、淋巴结转移，可作为患者病情进展情况评估的重要指标。

膀胱癌侵袭能力比较强，不过具体作用机制尚未完全明确。研究显示，下调PAK2 表达可抑制癌细胞生长增殖。本文中，在膀胱癌T24 细胞系中过表达MTA2 之后，癌细胞的侵袭及迁移能力均显著增强[7]。其原因可能与通过PAK/MAPK/HSP27 信号通路活化、PAK2磷酸化等有关[8]，进而发挥出促进癌细胞侵袭及转移，不过具体作用机制还需要进一步研究。

综上所述，膀胱癌组织中PAK2 阳性表达率较高，与膀胱癌的发展相关，且可以促进癌细胞的侵袭以及转移。