巨噬细胞对Fah 基因剔除小鼠肝细胞移植效率的影响

唐善花 周徐 于学波 曹丹 唐亮 郭琳娜 黄珊娜

（1 海军军医大学东方肝胆外科医院信号转导实验室 上海 200438）

（2 上海交通大学附属仁济医院麻醉科 上海 200127）

（3 海军军医大学附属东方肝胆外科医院病理科 上海 200438）

细胞移植是治疗肝病的有效手段之一，目前在肝衰竭和代谢性肝病临床应用中具有较为突出的治疗效果。现阶段全世界有近百位的患者进行了肝细胞治疗，大部分患者临床症状得到改善或者成功接受肝移植[1]。尽管短期疗效显著，肝细胞移植临床应用的最大挑战在于细胞移植后再生效率问题。细胞在体内的再生主要是细胞与周围环境共同作用的结果。而肝脏微环境主要由非实质细胞及其分泌因子构成，Kupffer 细胞是肝脏内主要的非实质细胞来源，其数量占肝脏细胞总体数量的15%，同时具备多样的生物学功能，参与肝脏正常合成代谢、肝脏疾病的发生发展等过程[2]。目前Kupffer 细胞在肝脏再生过程中的作用仍然存在较大的争议，有研究人员在肝切的模型中证明清除Kupffer 细胞后会延迟肝再生的过程[3]，也有人证明清除Kupffer 细胞后加速肝再生的过程[4]。体内肝再生的过程往往伴随着肝损伤，然而没有研究深入探讨Kupffer 细胞是否对肝损伤及肝细胞移植的效率有所影响。本研究采用Fah-/-小鼠模型模拟肝损伤及肝细胞移植过程，通过观察Fah-/-小鼠撤药后肝损伤过程中巨噬细胞的活化情况，并采用巨噬细胞清除或与肝细胞共同回输的方式进行肝再生效率以及病理学变化评价。

1.材料与方法

1.1 材料

Fah-/-小鼠（129S4 品系，体重20 ～25g，10 周龄，63 只），Fah-/-小鼠受赠于第二军医大学基础部细胞生物学教研室，繁育于第二军医大学信号转导实验室动物房，实验前在此小鼠饮用水中加入7.5mg/L NTBC（4-对羟苯丙酮酸二氧合酶活性抑制剂）维持小鼠正常生存。野生型小鼠（体重20 ～25g，129S4 品系，10 周龄）6 只，均正常进食。

1.2 动物分组与处理

9 只Fah-/-小鼠用于NTBC 药物撤除后观察肝损伤与巨噬细胞活化过程（3 只/时间点）；10 只Fah-/-小鼠用于验证脂质体清除巨噬细胞效果实验（实验组n=5，对照组n=5）；30 只Fah-/-小鼠用于巨噬细胞清除后肝细胞移植实验（10 只/时间点，每个时间点实验组n=5，对照组n=5），细胞移植后对照组与实验组均撤除NTBC 药物；4 只Fah-/-小鼠用于骨髓巨噬细胞的体外分离与培养；10 只Fah-/-小鼠用于巨噬细胞与肝细胞共同移植实验（实验组n=5，对照组n=5），细胞移植后对照组与实验组均撤除NTBC 药物；6 只野生型129S4 品系小鼠用于原代肝细胞的分离。

1.3 原代肝细胞分离与移植

采用原位两步灌流法与梯度密度离心法分离获得单个原代肝细胞后，采用台盼蓝染色法对肝细胞进行活率检测，使细胞活率在80%以上；采用Hank's 液将细胞洗涤2 遍，离心参数50xg，5min；最后重悬于William's E 培养基中，肝细胞悬液密度调整为5×105/ml。将小鼠麻醉后，经小鼠肋下开口暴露脾脏，采用脾脏注射移植细胞，每只小鼠移植体积为200µl 左右的肝细胞悬液，肝细胞数目为1×105/只。对照组注射200µl 的William's E 培养基。

1.4 小鼠巨噬细胞分离与培养

将小鼠两侧后肢股骨进行体外分离，再剔除骨头上多余的结缔组织以及肌肉，用于防止其他组织内的巨噬细胞混入。用刀片切除股骨两头，1ml 注射器吸入1640 完全培养基（10% FBS，1%青-链霉素），从股骨的一段进行反复推注，直至骨髓冲洗完全。收集培养皿中细胞悬液，以40ng/ml 的浓度比例添加GM-CSF 细胞因子，刺激骨髓中单核细胞向巨噬细胞的转化。经过12H 的培养后，收集未贴壁的细胞，重新将细胞接种入细胞培养皿中，每隔2 ～3d 换液1 次。

1.5 统计处理

再殖效率的评价采用Image J 软件分析；其余数据使用GraphPad Prism 7 进行统计学分析，采用双尾非配对t检验用于计算两组平均值之间的统计学差异性。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 Fah 基因剔除小鼠撤药后肝脏损伤的同时伴随着巨噬细胞的活化

Fah-/-小鼠是Grompe 等模仿人类遗传型酪氨酸血症I 型（hereditary tyrosinaemia type I，HTl）建立的模型小鼠。该小鼠由于Fah 基因的缺失，酪氨酸分解代谢受阻，导致酪氨酸中间代谢产物在体内的蓄积，从而引肝脏损伤。NTBC[2-（2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰基）-环己烷-1，3-二酮]可通过阻断有害物质的生成从而维持Fah-/-小鼠的生存与肝功能。撤除NTBC 药物后1 周、2 周、3 周，H&E 染色显示小鼠肝脏组织结构逐渐紊乱，并且出现局灶性坏死。免疫组化F4/80 染色结果显示，在此过程中伴随着巨噬细胞数目的增加（图1）。

图1 Fah 基因缺陷小鼠肝损伤的同时伴随着巨噬细胞的活化

2.2 清除巨噬细胞有利于提高肝细胞移植的重建效率

脂质体清除巨噬细胞的效率约为50%（图2A）。清除巨噬细胞后进行肝细胞移植，分别在1 周、2 周和4 周时间点进行观察。免疫组化Fah 染色与统计学显示，在细胞移植后前2 周，对照组与清除巨噬细胞组没有显著差异，而第4 周时清除巨噬细胞组定植细胞的克隆数目与大小明显多于对照组（图2C，D）。这说明巨噬细胞影响肝细胞的定植与再植。

图2 清除巨噬细胞有利于提高肝细胞移植的重建效率

2.3 Fah-/-小鼠骨髓巨噬细胞与肝细胞共同回输不利于肝细胞的体内增殖

将Fah-/-小鼠骨髓来源的单核细胞进行体外分离与培养，并在GMSF 生长因子的刺激下将其定向分化为巨噬细胞，经流式细胞术鉴定，经体外培养诱导的巨噬细胞（F4/80+/CD11b+）纯度为99.15%（图3A，B）。将巨噬细胞与新鲜分离的原代肝细胞按1:5的比例混合，共同移植入Fah-/-小鼠脾脏中。5 周后免疫组化染色及统计学显示，巨噬细胞与原代肝细胞混合组，肝脏重建比例明显降低，肝损伤也更为严重（图3C，D）。同时发现，巨噬细胞与原代肝细胞混合注射组的小鼠脾脏中，巨噬细胞特异标志物F4/80+细胞的数量明显多于对照组（图3E），由此我们认为巨噬细胞影响肝细胞移植过程中细胞在体内的增殖过程。

图3 巨噬细胞与肝细胞回输不利于肝细胞的体内增殖

3.讨论

肝脏具有十分强大的再生功能，不管是急性还是慢性肝损伤中均存在肝细胞的再生。在急性肝损伤中，由各类非实质细胞，如肝星状细胞、巨噬细胞等分泌的促肝再生信号分子，如IL-6、HGF 等分子会刺激肝细胞在短期内快速大量增殖，补充损失的肝细胞从而实现再生[2，5-6]，然而，在慢性肝脏损伤进程中，存在大量的炎性因子浸润及其相关的信号网络调控体系，如TNF-alpha 信号通路、FGF7、HGF 及EGF 等信号分子，这些信号可以促进肝前体细胞（liver progenitor cells，LPCs）的增生[7-9]。因此在体内，细胞实现增殖再生的过程实际上是由细胞与所处微环境共同作用的结果[10]。本研究通过实验证明了巨噬细胞妨碍了肝细胞移植中肝再生的过程。然而本次研究没有探讨巨噬细胞通过何种机制阻碍了外源细胞的增殖过程，比如巨噬

细胞的吞噬作用或者分泌因子起到了潜在的关键作用，又或者不同亚群的巨噬细胞对于肝细胞移植效率的影响有可能有差异。研究巨噬细胞在肝再生过程中的作用有助于帮助我们重新认识肝脏再生的过程，解决肝细胞移植临床应用的难题，本次研究有可能为临床肝细胞移植提供新的策略和参考。