母婴因素对脐血CD34+造血干/祖细胞的影响

贺晶 杨月明 刘伶 王东

（1.大连医科大学研究生院，辽宁大连 116000；2.大连市妇女儿童医疗中心血液肿瘤科，辽宁大连 116000）

脐血（umbilical cord blood, UCB）富含造血干/祖细胞（hematopoietic stem and progenitor cell,HSPC），在临床应用中，已证明移植输注的有核细胞总数（total nucleated cell, TNC）和CD34+细胞数量是快速植入和延长生存期的主要预测指标[1]，且与中性粒细胞恢复明显相关[2]。因此，UCB 库倾向于选择TNC 和CD34+细胞数量较高的UCB，具体数值规定因脐血库而异。但单份UCB 中TNC和CD34+细胞数量有限，更适用于治疗低出生体重儿[3]。本研究通过分析除胎龄外其他围生期因素与UCB 中TNC、CD34+细胞计数的关系，作为UCB 库合理选择UCB 的参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象

本研究纳入2019 年6 月至2020 年1 月大连市妇女儿童医疗中心产科无先天性疾病的健康孕妇，经孕妇或家属知情同意后，采集其分娩新生儿的UCB 用作科学研究。排除娩出的死亡/畸形新生儿。

1.2 一般资料收集

采用医院信息采集系统调查和收集围生期的相关信息，内容主要包括：孕母年龄、孕母血型（A/B/AB/O 型）、妊娠糖尿病（GDM）（无/有）、妊娠高血压（PIH）（无/有）、受孕方式（自然妊娠/辅助生殖）、分娩方式（顺产/剖宫产）、单胎/双胎，新生儿体重、性别、生后Apgar 评分（正常/异常），以及胎盘（正常/异常）、羊水胎粪污染（无/有）、脐带绕颈或身体其他部位（无/有）。所获得的调查资料双份录入自行创建的Excel 表格。

孕期疾病包括GDM、PIH，由我院产科医师于妊娠期间诊断，GDM 诊断标准参考第9 版《妇产科学》[4]及《妊娠合并糖尿病诊治指南（2014）》[5]，PIH 诊断标准参考第9 版《妇产科学》[4]及《妊娠期高血压疾病：国际妊娠期高血压研究学会分类、诊断和管理指南（2018）》解读[6]。羊水胎粪污染、脐带绕颈、Apgar 评分在胎儿分娩后由我院产科及新生儿科医师共同评估。

1.3 UCB 采集

在大连市妇女儿童医疗中心产房或手术室收集新生儿UCB 130 份（2～3 mL/份）。新生儿断脐后10 s 内行UCB 采集：选择距离胎盘断端约5～8 cm，用碘伏消毒两遍，消毒范围4～5 cm，穿刺针头斜面朝下或侧面小角度刺入，见血后沿血管壁顺行1～2 cm，采UCB 2～3 mL，止血钳夹闭穿刺点上端血管，取下针头，边采边混匀，填写标本信息，4℃冰箱暂时存放，并于24 h 内检测。

本课题获得产妇及家属知情同意，并经大连市妇女儿童医疗中心伦理委员会批准（2019015）。

1.4 TNC 计数

采用XN-350 全自动血液分析仪计数UCB 标本中的TNC。

1.5 流式细胞仪检测CD34+细胞占TNC 比例

根据细胞计数计算UCB 所需标本量（加入细胞数约2×106个），样品管中加入10 μL CD45 PercP 和20 μL CD34PE，震荡，混匀，室温避光孵育20 min，加1～3 mL 裂解液，震荡混匀，避光裂解10 min。以1 500 r/min 离心5 min，弃上清。各管加3～5 滴PBS 重悬，标记细胞用CantoII 流式细胞仪上机检测。通过质控品检测保证仪器运行状态正常。应用Diva 软件进行数据分析，取CD45弱阳、CD34 阳性、前向角散射较淋巴细胞大的细胞占CD45+细胞的比例，为CD34+细胞占TNC比例。

1.6 计算CD34+细胞数量

CD34+细胞数量=TNC×CD34+细胞占TNC比例。

1.7 统计学分析

采用SPSS 26.0 统计软件对数据进行统计学分析。正态分布计量资料用均数±标准差（±s,）表示，两组间比较采用成组t检验；非正态分布计量资料采用中位数（四分位数间距）[M（P25，P75）] 表示，组间比较采用U检验或Kruskal-WallisH检验。Pearson 相关性分析描述两个连续变量之间的相关性。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

采集到的130 例UCB 标本中，早产儿57 例（42.5%），足月儿73 例（57.5%）；单胎118例（90.8%），双胎12 例（9.2%）；顺产116 例（89.2%），剖宫产14 例（10.8%）；自然妊娠112 例（86.2%），辅助生殖18 例（13.8%）；男65 例，女65 例，男女比例为1 : 1；早产儿的平均出生体重为（2 488±560）g，足月儿平均出生体重为（3 354±395）g，其中包括5 个极低出生体重儿（＜1 500 g）。

2.2 母婴因素对UCB 中TNC 及CD34+ HSPC的影响

孕母情况：孕母平均年龄为（30±4）岁，相关性分析提示孕母年龄与UCB 中TNC 无明显相关性（r=0.132，P=0.134），与CD34+细胞计数呈正相关（r=0.262，P=0.003）。本研究纳入130 例新生儿母亲的血型均为Rh 阳性，A 型36 例（27.7%），B 型37 例（28.5%），AB 型15 例（11.5%），O 型42 例（32.3%），不同孕母血型的UCB 中TNC、CD34+细胞计数比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。

妊娠期疾病：37 例（28.5%）孕母患有GDM，有无GDM 孕母的UCB 中TNC、CD34+细胞计数比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。GDM孕母分娩新生儿体重为（2 973±699）g，无GDM孕母分娩新生儿体重为（2 975±619）g，两组间比较差异无统计学意义（t=0.018，P=0.986）。16例（12.3%）孕母患有PIH，有无PIH 孕母的UCB中TNC 及CD34+细胞计数比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。

受孕方式及分娩方式：受孕方式中，112 例（86.2%）为自然妊娠，18 例（13.8%）为辅助生殖；分娩方式中，116 例（89.2%）为顺产，14 例（10.8%）为剖宫产。不同受孕方式及分娩方式下，UCB 中TNC、CD34+细胞计数比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。

单胎/双胎：12 例（9.4%）新生儿为6 对异卵双胞胎，无同卵双胞胎标本，无三胎及以上新生儿UCB，单胎与双胎UCB 中，TNC、CD34+细胞计数比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。

新生儿情况：男65 例（50.0%），女65 例（50.0%），不同性别新生儿的UCB 中TNC、CD34+细胞计数比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。新生儿平均出生体重为（2 974±640）g，出生体重与TNC、CD34+细胞计数无明显相关性（分别r=-0.113，P=0.201；r=-0.159，P=0.070）。126例（96.9%）新生儿生后Apgar 评分正常（8～10分），其中117 例（90.0%）生后1、5、10 min Apgar 评分均为10 分，4 例Apgar 评分（3.1%）异常，Apgar 评分正常及异常新生儿UCB 中TNC及CD34+细胞计数比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。

其他：130 例UCB 标本中，102 例（78.5%）胎盘形态正常，28 例（21.5%）胎盘形态异常（如球拍状胎盘、副胎盘等），胎盘正常与异常组间UCB 的TNC、CD34+细胞计数比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。53 例（40.8%）有脐带绕颈或身体其他部位，有无脐带绕颈或身体其他部位组间UCB 的TNC 及CD34+细胞计数比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。5 例（3.8%）有羊水胎粪污染情况，有无胎粪污染组间UCB 的TNC 及CD34+细胞计数比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 母婴因素与UCB 中TNC 及CD34+细胞计数的关系 [M（P25，P75）]

续表1

3 讨论

自1988 年Gluckman 等[7]对一名范科尼贫血患儿首次成功进行UCB 移植以来，UCB 移植治愈了数百例血液系统恶性肿瘤或影响造血系统的遗传疾病[8]。与其他来源相比，UCB 具有许多优势：病毒污染的发生率少；可快速获得、长期保存；移植物抗宿主发生率较低，患者生存质量高；免疫原性较弱，可耐受非血缘 HLA1-2/6 个位点不合的移植等[9-11]。

本文采集母婴因素并分析各因素对UCB 中TNC、CD34+细胞计数的影响，以优化UCB 献血者的选择。迄今为止，产妇年龄对UCB HSPC 的影响争议比较大。Bielec-Berek 等[12]（n=50）研究结果证明产妇年龄与CD34+细胞计数无明显相关性。另外有报告产妇年龄是HSPC 浓度的影响因素[13]。本研究提示孕母年龄与UCB 的CD34+细胞计数呈正相关。分析原因为：本研究中孕母年龄分布在21～40 岁，大多数（93.8%）分布在25 岁以上，而女性25岁以后皮肤及身体各项机能开始慢慢变老，体内会产生过多的自由基，从而导致造血细胞增加。

孕期疾病：有研究发现GDM 不是影响UCB中TNC 的 因 素[14]，Hadarits 等[15]证 明GDM 产妇UCB 中CD34+细胞含量较多，Kong 等[16]报道GDM 母亲的UCB 胶质干细胞的分化潜能、氧化应激能力降低。本研究发现患GDM 产妇的UCB中TNC 及CD34+细胞计数与未患GDM 相当，与Hadarits 等[15]的研究存在差异，可能与本研究纳入的GDM 产妇饮食及运动血糖控制良好有关。有研究[17-18]（n=5 713）提示患有PIH 不会影响UCB中TNC 及CD34+细胞计数，而Nordin 等[19]（n=70）及Ahmed 等[20]（n=50）研究发现先兆子痫组的造血干细胞中CD34+细胞计数低于对照组。本研究结果为患PIH 母亲的UCB 中TNC 及CD34+细胞计数与未患PIH 相当。

目前关于分娩方式对UCB 影响的研究较多，但结果不尽相同。有研究发现阴道分娩UCB 质量优于剖宫产[21]，另有研究证明剖宫产UCB 中CD34+细胞数量较阴道分娩高[22]，而一些研究发现分娩方式不影响CD34+细胞的含量[23-25]。这些差异可能与种族、民族及地域相关[26]。本研究提示顺产与剖宫产的UCB 中TNC 及CD34+细胞计数比较差异无统计学意义；此外，本研究发现受孕方式、双胎、产妇血型、胎盘形态、羊水胎粪污染均不影响UCB中HSPC数量，与早期结果一致[27]。

有研究提示新生儿体重与UCB 中TNC、CD34+细胞计数无相关性[28]，而Nguyen 等[29]发现呈正相关。本研究提示新生儿体重与UCB 中TNC、CD34+细胞计数无相关性。大多数研究表明新生儿性别不影响UCB 质量[29-30]，但Bijou 等[31]在校正出生体重后发现男性新生儿UCB 中CD34+细胞含量较高。本研究结果为不同性别新生儿的UCB 中TNC 及CD34+细胞计数无差异，因此新生儿性别对UCB 中CD34+细胞计数不产生影响。Mazzoccoli 等[24]（n=17 936）研究提示新生儿Apgar 评分与UCB 质量呈负相关，可能与Apgar 评分异常增加新生儿呼吸窘迫发生率[32]有关。本研究提示Apgar 评分不影响CD34+细胞数量，可能与本研究中大多数（96.9%）Apgar 评分正常有关。

Al-Sweedan 等[27]（n=200）发现脐带绕颈新生儿UCB 中CD34+细胞计数增加。本研究发现脐带绕颈不影响TNC 及CD34+计数，分析原因可能与本研究中53 例脐带绕颈新生儿，大多数为绕颈1 周，较少引起脐带压迫及UCB 动力学改变有关。

当然，本研究仍然存在一些不足：（1）除课题研究的因素外，仍存在许多影响因素，例如孕母烟酒史、产次、分娩时间等均对胚胎发育有影响。（2）新生儿生后Apgar 评分、脐带绕颈两个因素，因样本分布不均、组间样本差异较大等原因，可能存在统计学误差。

本课题发现孕母年龄在25～40 岁时，UCB 中CD34+细胞数量随孕母年龄增大而增多。故脐血库在选择UCB 前，可以根据孕母年龄进行权衡和选择，旨在：（1）避免UCB 的CD34+细胞消耗；（2）增加TNC。而其余所研究围生期因素均不影响UCB 中CD34+细胞数量，因此，脐血库在筛选UCB 干细胞供者时，本研究结果可为扩大UCB 干细胞的采集范围提供参考。