基于NK细胞的免疫疗法在癌症治疗中的应用及其研究进展

李翠翠 陈梦梦 邹 伟，2* 张炳强*

（1 青岛瑞思德生物科技有限公司 山东青岛 266000 2 辽宁省生物技术与分子药物研发重点实验室 辽宁大连 116000）

自然杀伤（natural killer，NK）细胞是一类具有杀伤肿瘤细胞能力的天然免疫细胞，可通过细胞毒性和释放细胞因子等方式，抵抗病毒或肿瘤细胞的侵袭。作为人体重要的免疫细胞之一，NK 细胞在监视肿瘤的过程中发挥至关重要的作用，并以一种与抗原无关的方式表现出对异常细胞的强大杀伤能力。本文就NK 细胞及其功能、NK 细胞疗法与传统癌症治疗、癌症免疫治疗中常见的NK 细胞疗法、嵌合抗原受体（chimeric antigen receptors，CAR）NK（CAR-NK）细胞4 个方面进行简要综述。

1 NK 细胞及其功能

1975年，Kiessling 等[1]发现一类与淋巴细胞形态相似，但与T 细胞和B 细胞不同的，不需要预先刺激就能裂解肿瘤细胞的细胞，并且能直接通过表面受体识别病原菌，因此，将其命名为自然杀伤细胞。NK 细胞既不需要抗原致敏，也不需要抗体参与，且无主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex，MHC）限制。NK 细胞主要参与对病毒感染细胞、恶性转化的自体细胞或同种异体细胞的杀伤过程，同时，能快速响应病毒感染，参与抗肿瘤的免疫监视过程。NK 细胞是人体抵抗病毒感染和肿瘤细胞的第一道防线，能非特异性地直接杀伤肿瘤细胞，是免疫系统中最重要的效应杀伤细胞，也是固有免疫系统的重要成员，约占外周血淋巴细胞总数的10%～15%，同时存在于脾脏、肝脏、肺、骨髓和淋巴结中。它们通过与树突状细胞（dendritic cells，DC）的相互作用发挥关键的免疫调节功能，DC 细胞通过激活NK 细胞，促进其杀伤靶细胞，但反之，NK 细胞也作用于DC细胞，既促进其成熟，又对其产生杀伤效应。

根据细胞特征，人们通常将NK 细胞分为CD56brightCD16dim/-表型和CD56dimCD16+表型。前者通常不太成熟，但可分泌大量的细胞因子；而后者更成熟，占NK 细胞总数的90%，其细胞毒性更大，具有杀伤溶解靶细胞的功能，是天然抗肿瘤免疫的重要效应细胞[2]。NK 细胞的抗肿瘤作用依赖其细胞毒性，而细胞毒作用主要通过2 种途径杀伤肿瘤细胞：1）活化的NK 细胞释放穿孔素和颗粒酶介导靶细胞凋亡，启动凋亡相关程序；2）抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（antibodydependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）。 NK细胞被激活后，胞浆颗粒分泌穿孔素，使靶细胞的细胞膜上形成孔洞[3]；细胞膜破裂后，颗粒酶——丝氨酸蛋白酶被运送至细胞质中，从而诱导细胞凋亡。而NK 细胞表面具有FcγRIIC（CD32c）和FcγRIIIA（CD16a）识别受体，可与已结合在靶细胞表面的抗体Fc 段结合，从而杀伤与抗体结合的靶细胞，这一杀伤过程称为抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用。Rosenberg 等[4]最早于1985年就开始使用NK 细胞进行抗肿瘤治疗，研究发现，NK细胞联合IL-2 对肾癌、黑色素瘤的治疗，有效率为20%～30%。与LAK 细胞不同的是，NK 细胞治疗使用的是单一细胞，而LAK 细胞是NK 细胞或T细胞在体外高剂量IL-2 诱导下分化的细胞群。

2 NK 细胞疗法与传统癌症治疗

常规癌症治疗方法为手术后进行放疗、化疗等，在这一过程中难免会使肿瘤细胞产生应激，增加NK 细胞的活化配体，释放损伤相关分子模式分子（damage-associated molecular patterns molecules，DAMPs），诱导免疫原性的细胞死亡[5]。Guerriero等[6]在用DNA 烷化剂治疗无胸腺小鼠的肿瘤中发现，需要招募中性粒细胞和NK 细胞以清除肿瘤。Ruscetti 等[7]证实丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）和周期蛋白依赖性激酶4/6（cyclin-dependent kinase4/6，CDK4/6）抑制剂联合作用，可抑制KRAS 突变型肺癌细胞的增殖，并激发NK 细胞监视程序，导致肿瘤细胞死亡。Gasser 等[8]用高剂量辐射导致DNA 损伤后发现，与化疗作用相似，辐射也能通过ATM 和ATR依赖途径导致NKG2D 配体表达量增加，使NK 细胞和活化的CD8+T 细胞表达NKG2D 受体（也称为KLRK1 受体，是人MHC-I 配体的一种）。以上研究表明，虽然不同化疗药物（或辐射）作用机制不同，但手术切除仍然是许多恶性实体瘤的主要治疗方法，而手术的免疫调节机制尚不清楚，同时手术损害了NK 细胞的功能，从而为肿瘤的扩散和生长提供了机会[9]。因此，NK 细胞虽然在传统肿瘤治疗中发挥基础性作用，但在手术、放疗及化疗治疗后其相关功能有待进一步研究。

3 癌症免疫治疗中常见的NK 细胞疗法

过继免疫治疗通过向肿瘤患者移植经体外诱导培养的、从患者或健康供者体内获得的、自体或异体的免疫细胞，发挥直接或间接地杀伤肿瘤细胞的作用，达到治疗肿瘤的目的。

3.1 自体NK 细胞 目前，自体NK 细胞用于癌症免疫治疗，虽然NK 细胞可从患者的外周血中分离，可在体外扩增，但研究显示，NK 细胞的扩增比T 细胞的扩增更为复杂。Sakamoto 等[10]发现用自体NK 细胞对消化癌患者进行治疗，尽管体外扩增至4 720 倍，NK 细胞在体外具有高度溶解活性，并强烈表达功能标记物（例如，NKG2D 和CD16），依然没有观察到临床反应。同时，自体NK 细胞的功能状态和增殖往往较差[11]，这可能与NK 细胞分离前患者所接受的治疗有关，使其成为临床疗效较差的原因之一。针对这一问题，目前正在研究多种方法包括不同的激活细胞因子组合（例如，IL-2、IL-12、IL-15、IL-18），体外扩增过程中使用饲养细胞提供重要的细胞因子等[12]。

3.2 同种异体NK 细胞 由于癌症患者的NK 细胞功能高度失调，并且数量减少，因此，在癌症免疫治疗中，广泛探索了同种异体NK 细胞的过继移植治疗，从而诱导产生抗肿瘤的效应。Miller等[13]在进行异体NK 细胞回输的临床实验中发现，免疫抑制的AML 患者回输NK 细胞，并进行IL-2治疗后，IL-15 升高、NK 细胞数量增加，19 名患者中有5名患者的疾病得到缓解。人细胞系NK-92已被广泛用于异体NK 细胞治疗的临床研究。Tonn 等[14]的临床研究显示，将NK-92 细胞分2 次输注15 名处于具有耐药性的恶性肿瘤（肺癌、白血病、淋巴瘤）晚期患者，间隔48 h 后，75%的癌症患者产生一定的抗肿瘤反应，表明NK-92 细胞具有较好的疗效。但若将NK-92 细胞作为癌症治疗的一种新方法，仍需要大量研究验证其安全性。

诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）也能分化为NK 细胞，此种来源的NK细胞，无论在体内或体外，均证实对各种来源的肿瘤具有极高的细胞毒性[15]。Zeng 等[16]发现外周血iPSCs 来源的NK 细胞在体外人杀伤细胞免疫球蛋白样受体（killer cell immunoglobulin-like receptors，KIRs）的表达虽然较低，但对癌细胞同样具有细胞毒性，并可能产生ADCC，表明外周血iPSCs 可能作为产生NK 细胞的替代来源。

众多临床研究证实，同种异体NK 细胞不会引起移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD）[17]，表明同种异体NK 细胞的过继细胞治疗是安全的。与自体NK 细胞过继细胞治疗相似，同种异体NK 细胞过继细胞治疗体外培养的NK 细胞扩增激活，回输体内后持续存在。

4 嵌合抗原受体NK（CAR-NK）细胞

由于受NK 细胞数量少、细胞毒性低和无法迁移至肿瘤部位等多种因素的影响，使未修饰的自体或异体NK 细胞过继移植的临床应用受到限制。因此，对NK 细胞进行基因工程修饰使其表达高亲和力受体（例如，CD16）、靶向表面蛋白（例如，PD-L1、CD19、Her2 等）和内源性细胞因子（例如，IL-2和IL-15）对NK细胞存活和细胞毒性至关重要。

嵌合抗原受体技术是基因工程与免疫疗法的完美融合，是当前肿瘤治疗领域最具前景的研究方向之一。CAR 通常编码在慢病毒结构中，由细胞外抗原靶向结构域（外结构域）、跨膜结构域和一个或多个细胞内信号域3 个主要结构域组成，它们可建立新的激活途径，以增强靶细胞的溶解。

鉴于CAR-T 细胞的成功，CAR 现被用于增强NK 细胞抗肿瘤活性。2005年，Imai 等[18]利用基因修饰技术，将CAR-NK 细胞表面克服了自身的抑制受体，开启了NK 细胞基因修饰的先河。CARNK 细胞不仅通过CAR 特异性识别肿瘤表达的抗原，也可通过NK 细胞自身受体清除肿瘤。除了通过靶向肿瘤抗原指导CAR-NK 细胞杀伤肿瘤细胞外，已有人提出CAR-NK 细胞可清除肿瘤微环境中的免疫抑制细胞，包括骨髓源性抑制细胞（myelodi-derived suppressor cells，MDSCs）和M2 型肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associa-ted macrophages，TAMs）[19]。针对复发性或难治性CD19 阳性B 细胞恶性肿瘤患者的CD19 靶向CAR-NK 细胞治疗的Ⅰ/Ⅱ期临床试验（NCT03056339）中期结果显示，11例患者中有8 例对治疗有客观反应，并未出现主要毒性反应[20]。

5 小结

作为一种具有快速、有效的抗肿瘤能力的特殊免疫表达细胞群，无论是否使用CAR，过继性NK细胞的移植均可提供一种更安全、更可行的替代方法，至少可作为基于T 细胞治疗方法的补充。NK细胞易于获取、来源更多，使利用自体或异体NK细胞治疗疾病具有很大的潜力，特别是能增强免疫疗法的抗癌效果，并降低免疫治疗的毒性反应。