熊去氧胆酸小檗红碱酯的制备

2021-01-19龙硕刘珍宝彭东明刘晓钦蒋婷刘艳飞

中南大学学报（自然科学版） 2020年12期

龙硕，刘珍宝，彭东明，刘晓钦，蒋婷，刘艳飞

（1.中南大学化学化工学院，湖南长沙，410083；2.中南大学湘雅药学院，湖南长沙，410013；3.湖南中医药大学药学院，湖南长沙，410208）

小檗碱（berberine，BBR）是天然药物黄连中的主要有效成分，故又称为黄连素。小檗碱化学结构是一类含喹嗪的生物季铵碱[1-2]。研究表明小檗碱作为一类天然产物，毒副作用小，具有降血脂[3]、降血糖[4]、抗菌[5]、抗肿瘤[6]等药理作用。小檗碱由于其溶解性和渗透性差，在体内不容易被吸收，生物利用度低，因此，对小檗碱进行结构修饰成为了研究热点[7]。目前，对小檗碱的结构修饰主要集中在其异喹啉环的N（7），C（8），C（9），C（12）和C（13）这5个位置单位点或者双位点改造。BIAN等[8]将小檗碱芳香族季氮还原为叔氮，然后烷基化生成N-烷基衍生物，再氧化生成N-氧化物，并探究了体外的降糖活性。YANG 等[9]以小檗碱为原料，以环小檗碱为先导化合物合成了一系列新的8-取代环小檗碱衍生物，研究发现其对革兰氏阳性病菌的抗菌活性比小檗碱的强。LIU 等[10-11]合成了一系列新的9-O 取代小檗碱衍生物，并对其抗炎活性进行了评价，与小檗碱相比，布洛芬和萘丙嗪修饰的小檗碱衍生物具有增强抗炎活性的作用。ENKHTAIVAN等[12]在小檗红碱C（12）上连接哌嗪类分子，合成了哌嗪类小檗碱衍生物，并发现小檗碱衍生物的抗流感活性较小檗碱的强，其中，对氟苯基取代的哌嗪小檗碱抗流感活性较对照药物奥司他韦强。PARK等[13]通过在小檗碱和小檗红碱的13-C中引入不同的芳香基团，合成了一系列13-取代苄基的小檗碱和小檗红碱衍生物，并对其抗真菌活性进行了研究，研究发现合成的化合物具有比小檗碱和小檗红碱更强的抗真菌活性。鉴于此，基于小檗碱药物功能需求，各类不同药理活性的修饰基团或化合物被设计并连接于小檗碱各个位点，为小檗碱衍生物合成提供了实验基础。熊去氧胆酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）最初由北极熊胆内提取出来，作为一种次级胆酸[14]，其结构中包含甾体母体及羟基、羧基双官能团。传统中药中熊胆曾被用来清除毒素、治疗肝疾和眼疾[15]。现阶段研究报道UDCA 具有溶解胆固醇结石[16]，有利于治疗胆汁淤积性肝功能疾病，并显著降低胆汁中胆固醇饱和度的优良药物性能[17]。在药理学方面，因为它具有很好的疗效且没有毒副作用，被认为是很好的治疗胆结石的药物[18]。因此，UDCA 在临床上主要用于治疗高血脂和肝胆疾病[19]。本文作者拟以熊去氧胆酸修饰9-O 小檗碱，期望2种具有降脂功能的药物能在体内发挥出协同作用，并通过引入熊去氧胆酸，改善小檗碱酯油水分配系数以提高生物利用度，增强降脂活性。通过直接偶联实验发现，小檗红碱修饰位点酚羟基酯化活性较低，且空间位阻大，难以与熊去氧胆酸直接酯化连接，故采用桥连[20]的方法修饰小檗碱。

1 实验

1.1 样品与试剂

样品有小檗碱（湖南湘泉制药有限公司生产）和熊去氧胆酸（湖南云港生物科技有限公司生产），其他试剂和溶剂均为分析纯。

1.2 小檗红碱的制备

称取10.0 g（0.028 mol）小檗碱，在温度为190 ℃、压力为2.67 kPa 真空干燥箱中反应0.5 h，小檗碱黄色粉末完全变为暗红色固体。将小檗碱黄色粉末冷却至室温，将其用中性氧化铝柱（流动相用乙醇与二氯甲烷体积比（V（乙醇）：V（二氯甲烷））为1：9）进行分离，浓缩收集液，于35 ℃旋转蒸发，得到暗红色纯品化合物Ⅰ小檗红碱，产率为94.6%。

1.3 直接酯化法制备熊去氧胆酸小檗红碱酯

称取0.50 g（1.56 mmol）小檗红碱置于50 mL圆底烧瓶中，加入20 mL 除水CH3CN，超声使其充分溶解，然后在体系中加入0.095 g （0.78 mmol）4-二甲氨基吡啶（DMAP）和0.61 g（1.56 mmol）熊去氧胆酸，在恒温磁力搅拌器上搅拌5 min 后加入0.15 g （0.78 mmol）1-乙基-（3-二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐）（EDCI），在25 ℃下搅拌反应12 h，利用薄层色谱（TLC）（V（乙醇）：V（二氯甲烷）=1：10 为流动相）监测反应。

1.4 熊去氧胆酸-β-溴乙酯的制备

称取1.0 g（2.55 mmol）熊去氧胆酸白色粉末置于50 mL圆底烧瓶中，将其溶于10 mL二甲基甲酰胺（DMF）溶液并在体系中滴加3 mL 1，2-二溴乙烷，在不断搅拌下加入1.4 g K2CO3。对反应体系在常温（25 ℃）下搅拌，利用TLC（V（乙酸乙酯）：V（石油醚）=2：1，为流动相）监测，4 h反应完全。过滤除去反应液中K2CO3固体，加入20 mL 氯仿萃取3次，收集合并萃取液，先后用50 mL饱和NaHCO3溶液、50 mL 饱和NaCl 溶液洗涤，洗涤后加入适量无水MgSO4干燥24 h。于30 ℃旋蒸浓缩反应液，以硅胶为固定相，V（乙酸乙酯）：V（石油醚）=1：1为流动相进行柱层析分离，收集合并分离液，蒸干溶剂得白色粉末状固体，得目标化合物Ⅱ，产率为73.1%。

1.5 熊去氧胆酸-（9-O-乙基）-小檗红碱酯的合成

称取0.50 g（1.4 mmol）化合物Ⅰ，0.75 g（1.5 mmol）化合物Ⅱ以及0.025 g KI（0.15 mmol）于50 mL 圆底烧瓶，加入10 mL DMF 使其充分溶解，体系在60 ℃下搅拌反应10 h，利用TLC监测，反应完全。冷却至室温，滴加乙醚至析出晶体，将其抽滤，滤饼于35 ℃真空干燥12 h，得到粗品黄色固体。粗产品以中性氧化铝柱为固定相，V（乙醇）：V（二氯甲烷）=1：10为流动相进行柱层析分离得暗黄色最终产物目标化合物，产率为72.5%。

2 实验结果与讨论

2.1 熊去氧胆酸小檗红碱酯合成

熊去氧胆酸小檗红碱酯的直接偶联法合成路线见图1。

通过对反应条件的多次探究，发现小檗红碱与熊去氧胆酸难以直接酯化，分析其原因可能是：一方面，熊去氧胆酸是一类天然有机弱酸，作为酯化反应中心的羧基表现出较低的反应活性；另一方面，小檗红碱中羟基为酚羟基，受苯环共轭效应与临位甲氧基空间位阻的影响，难以同熊去氧胆酸酯化缩合。而桥连法能有效解决分子间因空间位阻较大而难以偶联的难点，因此，将熊去氧胆酸小檗红碱酯的合成策略改变为桥连合成法。

熊去氧胆酸小檗红碱酯的桥连法合成路线见图2。

图1 化合物L1的合成路线Fig.1 Synthesis route of compound L1

图2 化合物L2的合成路线Fig.2 Synthesis route of compound L2

对所合成的化合物使用Bruker Avance III 400 MHz 核磁仪进行氢谱和碳谱表征，使用Bruker compact Q-TOF质谱仪进行质谱表征。

中间体熊去氧胆酸-β-溴乙酯的核磁共振氢谱图如图3所示。其1H NMR（400 MHz，CDCl3）表征数据为：化学位移δ 4.38（t， J=6.1 Hz， 2H），3.58 （dd，J=10.3， 5.5 Hz， 2H），3.51 （t， J=6.1 Hz，2H），2.40（ddd， J=15.1， 9.9， 5.1 Hz， 2H），2.34～2.20 （m， 2H），0.95（s，6H），0.68（s，3H）（其中，s指单峰，d指双重峰，t指三重峰，m指多重峰，dd指双二重峰，ddd指对称的2 个dd 峰）。由图3 可以看出：在接入溴乙基之后，在化学位移4.38和3.58处出现2组三重峰，为溴乙基上乙基的峰，表示小檗红碱酯成功与熊去氧胆酸相连接，而由于溴乙基的影响，熊去氧胆酸环上面氢的化学位移都产生微小变化。

图3 熊去氧胆酸-β-溴乙酯的核磁共振氢谱图Fig.31H NMR spectrum of ursodeoxycholic acid-βbromoethyl ester

目标化合物熊去氧胆酸小檗红碱酯的核磁共振氢谱如图4所示。其1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）表征数据为：化学位移δ 9.85 （s， 1H），8.99（s， 1H），8.22 （d， J=9.1 Hz， 1H），8.02 （d， J=9.1 Hz，1H），7.81（s，1H），7.10（s，1H），6.18（s，2H），4.95（t， J=5.9 Hz， 2H），4.54 （d， J=4.2 Hz， 2H），4.47（t， J=3.4 Hz， 2H），4.07 （s， 3H），0.86 （s， 6H），0.54（s，3H）。由图4 可知：在化学位移6~8 之间出现多组峰；对应的是小檗碱母体苯环上氢的峰；化学位移4.95 和4.47 对应的是溴乙基的峰；化学位移0.5~2.5之间对应的是熊去氧胆酸母体的峰。

图4 化合物L2的核磁共振氢谱图Fig.41H NMR spectrum of compound L2

目标化合物熊去氧胆酸小檗红碱酯的核磁共振碳谱如图5所示。其13C NMR（101 MHz，DMSO-d6）表征数据为：化学位移173.7，150.6，150.4，148.3， 145.8， 143.0， 138.0， 133.5， 131.1，127.2， 124.1， 122.1， 120.9， 120.8， 108.9，105.9， 102.6， 72.3， 70.2， 70.0， 64.0， 57.6，56.2，55.1，43.6，43.5，42.6，39.1，38.2，37.7，36.3，35.3，34.2，31.3，31.1，30.7，28.6，27.1，26.9，23.8，21.3，18.7，12.5，12.4。碳谱表征结果与化合物小檗红碱熊去氧胆酸酯分子式的结构特征相符。

图5 化合物L2的核磁共振碳谱图Fig.513C NMR spectrum of compound L2

熊去氧胆酸小檗红碱酯的质谱如图6所示。经数据分析可知：其分子离子峰质荷比（m/z）为740.451 1，这与[C45H58NO8+]的质荷比预测值740.42相吻合，确定为目标化合物。

2.2 反应条件优化

在酯化反应中，将熊去氧胆酸与二溴乙烷反应制备出熊去氧胆酸-β-溴乙酯，该步反应所优化条件与产率见表1。

图6 化合物L2的质谱图Fig.6 Mass spectrum of compound L2

表1 酯化反应合成条件Table 1 Synthesis conditions of ester formation reaction

首先对反应温度进行考察。由表1可知：在温度为20~40 ℃时，温度与产率的关系呈现出近似抛物线关系；25 ℃时，产率最高，达73.1%。造成这种趋势的原因在于在碱性环境中，较低温度无法提供反应所需达到能垒的能量，从而使得产率稍低；随着温度提升，卤代烃发生消除反应的趋势增大，故产率又有所下降，但因为缚酸剂K2CO3作为固相与整个液相体系分离，碱性较低使得下降程度并不十分明显。而TLC 显示，反应从1 h开始便有产物点生成，4 h后反应结束，延长反应时间对产率无明显提升。

选择DMF、乙酸乙酯（EA）和乙醇（EtOH）为溶剂，发现熊去氧胆酸能很好地溶于DMF 与EtOH，在EA中溶解度较低，以DMF为溶剂时产率最高，达73.1%，而在EA 中反应产率稍有降低，这可能是反应底物在该溶剂中的溶解度下降所致。虽然底物能很好地溶于EtOH，但产率骤减至17.2%，其原因可能是：作为溶剂的乙醇同时也是该步亲核取代反应的竞争物质，从而导致反应不充分，副产物主要为乙基-β-溴乙基醚。考虑到该步反应将产生游离HBr，需要加入适量缚酸剂以促进反应正向进行，根据已有研究，首先选择最为常见的K2CO3作为缚酸剂；随后，考虑到K2CO3的加入使得反应体系为非均相反应，又选择常用的有机缚酸剂吡啶进行研究。结果表明：作为缚酸剂，吡啶的效果略微优于K2CO3的效果，产率达到74.7%，虽然以K2CO3为缚酸剂的产率（73.1%）略低于吡啶为缚酸剂的产率，但考虑到后续处理简便以及试剂的毒性，选择K2CO3为最优缚酸剂。

制备得到熊去氧胆酸-β-溴乙酯后，将其与小檗红碱进行亲核取代反应，并对该步反应中的反应温度、反应时间、溶剂种类、催化剂种类及用量进行条件优化，结果见表2。

由表2可见：随着温度升高，醚化反应产率与温度呈抛物线关系，最优温度为60 ℃。当催化剂用量为0.10 时，产率为72.5%；当催化剂用量为0.15时，产率为72.6%。经综合考虑，最优条件选用催化剂用量为0.10。结合酯化反应最高产率为73.1%，所得熊去氧胆酸小檗红碱酯的总收率为53.0%。

表2 醚化反应合成条件Table 2 Synthesis conditions of ether forming reaction

在反应过程中，酯化反应时间为4 h，而醚化反应需10 h 完成，这也进一步说明在小檗红碱与熊去氧胆酸的缩合连接中，小檗红碱是整个反应的关键，需解决其羟基活性不足、所受空间位阻较大的问题。

在溶剂的选择上，已验证EtOH作为溶剂对反应体系的消极影响，改用非质子溶剂四氢呋喃（THF）。结果表明，DMF 仍是最优的溶剂。最后，考虑到该步反应引入了连接点周围空间位阻较大的小檗碱，选择卤酸盐进行催化反应，并对催化剂的种类与用量进行筛选，发现当不使用任何催化剂时，该步反应产率仅有53.6%，而KI 对该步反应有明显的催化效果，使得产率增加至72.5%。KCl 对反应几乎没有催化作用，产率为56.8%。反常的是，KBr的加入使得反应产率较不添加催化剂时更低，产率仅为39.2%，其原因在于溴化钾的同离子效应使得熊去氧胆酸-β-溴乙酯中的溴元素去除难度增加，从而对反应产生了抑制作用。