母乳中脂溶性维生素的HPLC法建立及前处理方法

2021-01-18刘慧敏聂琴黄召杨梦竹吴梦迪曹晓琴

食品工业 2020年12期

刘慧敏，聂琴，黄召，杨梦竹，吴梦迪，曹晓琴

江汉大学医学院（武汉 430056）

脂溶性维生素是机体生命活动所必需的营养物质[1-2]，但这些营养素储存在肝脏和脂肪组织中并且消除较慢，过量摄入FSV可能会对人体造成危害[3-4]。而母乳作为婴儿的主要营养供给，其维生素的含量对母乳的成分组成十分关键[5-7]。母乳中的脂溶性维生素的测量对于保证母乳品质非常重要。

文献通常采用高效液相色谱（HPLC）法[8-11]或荧光检测分析[12]或液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS）法[13]分析食品中的脂溶性维生素。考虑到维生素在母乳中的含量一般在毫克与微克之间，所以试验采用简单快速的HPLC进行检测。然而由于母乳基质的复杂性，不同稳定性使脂溶性维生素的提取过程至关重要，母乳中脂溶性维生素常被包被在脂肪或脂溶性杂质中，对脂溶性维生素的测定造成极大干扰[14-16]，此外，如果应用的提取方案无法有效去除脂质，高脂肪含量会影响色谱效率，缩短色谱柱寿命，降低分析物回收率。因此，对母乳中的脂溶性维生素前处理方法进行探究具有重要意义。文献中最常用的方法为热皂化法[17]。然而由于脂溶性维生素的不稳定性，容易受到光、氧、热和酸碱因素的影响，热皂化法容易导致维生素D及类胡萝卜素的异构化以及维生素K4和叶黄素的降解[6]。随着技术的不断革新，对于基质中的脂溶性维生素的提取有了更多选择。低温酶解皂化技术、液液萃取、固相萃取和超临界流体萃取技术使得脂溶性维生素的提取效率明显提高[18]。但母乳中的脂溶性维生素必须采用破壁技术释放，常规的皂化法、酶解法和有机溶剂法等，其破壁的程度和稳定性不同，对回收率的影响很大。试验建立薄层层析（TLC）分离法前处理母乳中的脂溶性维生素，通过各种前处理方法比较，为测定脂溶性维生素时前处理方法的选择提出建议，为母乳中的脂溶性维生素的测定提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

母乳（健康产妇亲友捐赠）；蒙牛全脂甜奶粉（市售）；维生素A醋酸酯、维生素E对照品（纯度均≥96%，上海源叶生物科技有限公司）；木瓜蛋白酶（赛国生物科技有限责任公司，批号P-3250，活性0.5～2 U/mg）；维生素C（批号20180301，华中药业股份有限公司）；G型薄层硅胶板（批号20190205，青岛海浪硅胶干燥剂有限公司）；其余试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 仪器与设备

安捷伦1220高效液相色谱仪配紫外检测器和LC solution色谱工作站；WH-3微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）；ME104E电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；超声波清洗器（昆山美美超声仪器有限公司）；旋转蒸发器（上海申生科技有限公司）；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（河南省予华仪器有限公司）；TD6A低速离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Wonda Sil C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相，甲醇；流速0.8 mL/min；柱温30 ℃；进样体积10 μL；检测波长300 nm；运行时间10 min。

1.3.2 对照品溶液的制备

标准对照品贮备液的配制。精密称取10.0 mg维生素A醋酸酯、维生素E对照品，用1 mL甲醇溶解、定容，分别制成质量浓度10.0 mg/mL标准贮备液，-20 ℃避光保存。

混合对照品标准工作液的配制。精密量取标准贮备液各1 mL，加入空白样品提取液中，定容到10 mL，制成质量浓度1.0 mg/mL的混合标准工作液，4 ℃避光保存。

1.3.3 供试品的制备

母乳样品：分别于早、中、晚各取3位健康产妇的乳汁各10 mL，每位产妇的早、中、晚乳汁混匀作为供试母乳样品。

奶粉样品：随机取20 g同一批号的供试品，混匀作为试样。采用建立的检测方法进行空白基质的筛选，测定结果为无任何干扰峰的基质作为空白基质，用于样品添加试验。

1.3.4 前处理条件

取10 cm×20 cm，厚度0.25 mm硅胶G板于110 ℃活化30 min备用。

准确称取2.00 mL母乳（精确至0.01 g）至50 mL塑料离心管中，加入10 mL无水乙醇沉淀蛋白质；加入10 mL正己烷，超声提取15 min，加入2 mL饱和氯化钠溶液抑制乳化，混匀后以4 000 r/min离心10 min分层，取正己烷层，旋转蒸发挥干溶剂，加入1 mL二氯甲烷，振荡溶解残渣。

准确称取2.00 mg奶粉样品（精确至0.01 g）至50 mL塑料离心管中，加入20 μL一定浓度混合标准工作液，加入2 mL 50 ℃温水使奶粉溶解，加入10 mL无水乙醇沉淀蛋白质；后面步骤同1.3.5母乳操作步骤。

点样。取溶液全部点于10 cm×20 cm硅胶板上，同时点标准混合工作液。

层析。用100%二氯甲烷展开剂层析，上行9 cm处取出，晾干。

显色。使用95%乙醇-浓硫酸（1∶1，V/V）作为显色剂，均匀喷于板面，置于105 ℃恒温烘箱中烘10 min后取出。

收集。用刮刀刮下样品点对应标准混合液的显色区，用1 mL甲醇振荡溶解，取上清液通过0.22 μm滤膜过滤。

2 结果与分析

2.1 前处理方法的选择

2.1.1 TLC分离法的优化

2.1.1.1 溶剂的选择

综合文献[19-21]报道，分别以石油醚、正己烷、二氯甲烷为提取溶剂，以100%氯仿为展开剂，分别考察提取剂效果。结果表明，采用石油醚、正己烷、二氯甲烷分别作为提取溶剂时维生素A和维生素E的平均回收率分别为71.4%和67.1%，94.5%和92.1%，65.8%和57.1%，RSD分别为0.35%和0.41%，0.12%和0.17%，0.32%和0.27%。由此可知，采用正己烷作为提取溶剂时待测物提取回收率最高且稳定性最好，因此选择正己烷作为提取溶剂。

2.1.1.2 展开剂的选择

根据文献[19]报道，分别以环己烷-石油醚（8∶2，V/V）、100%二氯甲烷、100%氯仿为展开剂，以正己烷为提取溶剂，计算不同展开剂条件下的Rf值。结果发现，以100%二氯甲烷为展开剂时，能在0.5 h内使得维生素A与维生素E完全分离，并且能够得到较好分离比，根据100%二氯甲烷展开时的Rf1=0.36，Rf2=0.92，以上述操作点样层析上行9 cm，展开时间15 min（见图1），维生素E上行至3.2 cm处得高约0.2 cm的椭圆形斑点，维生素A上行8.3 cm处得高约0.2 cm的圆形斑点，斑点分离度完好，Rf1=0.36，Rf2=0.92。故选择以100%二氯甲烷为展开剂，层析上行9 cm。

图1 不同展开剂的展开距离考察

2.1.2 几种前处理方法的比较

为得到最优的提取方法，依次对文献采用的低温酶解皂化法[21-22]、溶剂直接萃取法[23]、固相萃取法[24]分别进行试验，同时与试验优化的TLC法进行比较。

通过对4种提取方法的提取回收率进行比较，溶剂直接萃取法、低温酶解皂化法和TLC分离法提取2种维生素的平均回收率均达90%以上，而经固相萃取法后平均回收率在70%～80%之间，这与文献[25-26]报道一致。溶剂直接萃取法和TLC分离法均采用有机溶剂直接破壁同时提取，而低温酶解皂化法以及固相萃取法采用皂化法进行破壁处理，明显发现当皂化处理奶粉样品的时候，会造成脂溶性维生素的损失，采用酶溶液处理后再在较低温度下破壁处理时，能减少母乳中的脂溶性维生素损失，但就相对有机溶剂破壁和提取而言，提取率仍较低。由此可见，4种前处理方法中TLC分离法能够得到最佳回收率。

各前处理方法所得的添加混合标准品的样品溶液HPLC色谱图如图2所示。TLC分离法的杂质峰数量少，而且与主成分分离度完好，不干扰主成分的出峰，为较为理想的前处理方法。

图2 采用TLC方法得到的HPLC色谱图

2.2 HPLC色谱条件的优化

2.2.1 检测波长的选择

在单一波长下采用紫外检测器同时测定多种脂溶性维生素时需要选取最佳吸收波长，因此试验分别吸取2 mL维生素A与维生素E的标准品储备液于190～500 nm范围内进行全波长扫描，结果得维生素A在324 nm处有最大吸收波长，维生素E在293 nm处有最大吸收波长，通过脂溶性维生素样品在各波长下的分析，发现当检测波长300 nm时，维生素A与维生素E均能得到较好响应值。

2.2.2 流动相的选择

结合文献[26-27]报道，试验对以甲醇为基础溶剂的溶剂体系甲醇、甲醇-水（9∶1，V/V）、甲醇-异丙醇-醋酸缓冲盐（9∶1，V/V）作流动相时的分离效果进行考察，发现以甲醇-水（9∶1，V/V）为流动相进行梯度洗脱时，基线发生严重漂移，待测物保留时间稳定性差；以甲醇-异丙醇-醋酸缓冲盐（9∶1，V/V）为流动相时，基线平稳，但维生素A出峰的时间窗内有一很强的杂质峰，会对维生素A的出峰会造成一定程度上的干扰；以甲醇为流动相时，维生素A与维生素E能在10 min内完全分离，基线平稳，维生素A和维生素E保留时间稳定性好，峰形完好，杂质峰与主峰分离度较好，因此试验选择甲醇作为流动相，维生素A的保留时间为3.65 min，维生素E的保留时间为8.02 min。

2.3 方法学考察结果

2.3.1 线性范围，检出限与定量限

利用配制成的空白样品中加入混合标准溶液，按5，10，50，100，200和500 μg/L的水平添加，进样检测，绘制标准工作曲线。以峰面积Y对进样质量浓度X进行线性回归，以RSN=3计算检出限，以RSN=10计算定量限）。以空白奶粉基质溶液添加标准品溶液，测得2种维生素的检出限与定量限。由表1可知，2种药物的质量浓度在5～500 μg/L范围内，线性关系良好。

表1 维生素A和维生素E的线性回归方程、相关系数、检出限及定量限

2.3.2 准确度和精密度试验

准确度用回收率表示，分别加入高、中、低3种质量浓度（5，10和20 μg/L）混合标准储备液，按照1.3.5的样品处理方法制备奶粉样品，取10 μL连续进样6次，根据峰面积，采用外标法计算回收率及RSD。通过连续5 d进行同样的试验，以回收率表示方法的准确度，x±s表示方法的精密度。根据分析，维生素A和维生素E的回收率82%～98%，变异系数≤15.5%。这些数据均符合分析方法标准对准确度和精密度的要求。