秸秆酶解液脱毒工艺对异养小球藻发酵的影响

杨磊，辛纳慧，李钰媛，刘雨，毕生雷，张乃群*

1. 南阳师范学院生命科学与技术学院（南阳 473061）；2. 河南天冠企业集团有限公司车用生物燃料技术国家重点实验室（南阳 473000）

微藻食品是既新颖又传统的食品。与其他传统藻类食品相比，微藻食品含有多肽、藻蛋白、不饱和脂肪酸和藻多糖，能够对糖尿病患者、心脏病患者、高血压患者、低免疫力人群起到良好的保健作用。微藻食品中含有的嘌呤还具有抑制胆固醇形成、促进胆固醇分解排泄、降低血脂的功效。同时，食用微藻食品还富含膳食纤维，能够增加饱腹感，有助于帮助肥胖人群减肥。因此，继螺旋藻之后，小球藻、雨生红球藻也越来越多地被用于保健品，微藻食品也越来越多地受到关注。异养小球藻与其他自养藻类相比，具有不占用耕地、不受气候因素影响、可利用工业化生产装置、生长周期短、含油量高等优点，但由于异养小球藻培养成本高，相关产品一直未能推出市场[1]。使用秸秆能够大幅降低异养小球藻原料成本，从而为产业化奠定基础。

秸秆是指农作物成熟脱粒后剩余的茎叶部分，通过农作物的光合作用，农作物中有一半的产物遗留在秸秆中[2]。在生活中秸秆是天然的绿色饲料，有机质含量约15%，碳水化合物含量约30%，1 t秸秆的营养价值相当于0.25 t粮食[3]，因此近年来秸秆越来越多地被用于替代粮食成为生物发酵的原料。秸秆的有效利用能够解决长期以来生物发酵与民争粮的问题和秸秆未充分利用带来的环境污染问题。秸秆的化学组成主要包含有半纤维素、木质素，约占固体物料总质量的80%，还有少量果胶、淀粉和单宁。秸秆天然的抗解结构阻碍纤维素降解为可发酵的糖类[3]，蒸汽爆破是应用较多的秸秆预处理方法，但随之产生的香草醛、阿魏酸、愈创木酚等物质能够抑制大部分微生物的正常生长，脱毒工艺成为消除抑制物的关键[4]。

常用的脱毒方法包括活性炭吸附、中和法、膜蒸馏法、酶处理法等，这些新兴脱毒方法在降低抑制物含量的同时还存在着试剂残留、成本高、糖损失多等各种问题，不利于规模化应用，寻找成本低、易操作的脱毒工艺有助于推动秸秆作为生物质能源原料的应用进程。蒸汽爆破产生的酸类、酚类、醛类抑制物均溶于水，且沸点普遍低于300 ℃，水洗法能够使抑制物溶于水并随着滤液脱离秸秆爆破料，高温烘干法则能够使抑制物汽化、脱离秸秆爆破料，水洗+滤液回收则是在水洗法基础上优化以提高糖利用率的工艺，这几种工艺都有工艺简单、设备投资小的特点。拟在3种工艺的基础上研究秸秆酶解液脱毒工艺对异养小球藻发酵结果的影响，以降低异养小球藻的培养成本。

1 材料与方法

1.1 试验材料

异养小球藻（清华大学生命科学院）；玉米秸秆、黑曲霉、纤维素酶（河南天冠企业集团有限公司）；沸石粉、葡萄糖、酵母粉、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氢氧化钠等（国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 试验设备

蒸汽爆破装置、洗涤装置（自制）；LNB2.5-10F型马弗炉（上海皓庄仪器有限公司）；FE20-FiveEasy Plus型pH计（梅特勒-托利多集团有限公司）；202-2型电热恒温干燥箱（上海博珍仪器设备）；L400型离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；YXQ-WF型灭菌锅（上海印溪仪器仪表有限公司）；ZWY-111B型摇床（上海智诚仪器设备有限公司）；DK-600型恒温水浴锅（上海精密科学仪器有限公司）；SC-237型展示柜（青岛澳柯玛股份有限公司）；安捷伦2100型液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 秸秆爆破预处理方法

使用蒸汽爆破预处理，将玉米秸秆烘干至恒质量，过60目筛，室温密封储存。准确称取50 g 样品，将5 g水雾化均匀喷洒在试样上。装入塑料袋密封，室温条件下浸润12 h。将试样进行蒸汽爆破（汽爆条件为蒸汽压强2.2 MPa、压力维持时间200 s）预处理，汽爆后收集物料备用[5]。

1.3.2 脱毒方法

1.3.2.1 水洗脱毒法

将一定量的汽爆玉米秸秆，按m（秸秆）∶m（水）=1∶7.5比例混匀搅拌，浸泡60 min后过滤，滤渣80 ℃烘干至恒重，作为酶解的原料[6]。

1.3.2.2 水洗+滤液回收脱毒法

将一定量的汽爆玉米秸秆，按m（秸秆）∶m（水）=1∶1比例搅拌混匀，以3 000 r/min离心后，将非溶性固体与60 ℃的相同体积的水混合均匀，反复5次（每次减少洗水体积20%）直至过滤后洗水液呈无色，合并洗水液，并将其放入真空干燥箱中于真空度0.03 MPa下65 ℃浓缩，直至洗水液体积减少50%～70%。向浓缩液中加入沸石粉20%，静置6 h后取出，以3 000 r/min离心，汲取上清液与爆破物的非溶性固体混合，以此作为酶解的原料[7]。

1.3.2.3 高温烘干脱毒法

将汽爆玉米秸秆于125 ℃烘至恒质量，以此作为酶解的原料[8]。

1.3.3 洗涤方法[9]

单次洗涤：取适量脱毒后原料，按一定固液比与蒸馏水充分混匀，用氨水调节pH为4.8，滤去游离水以此作为酶解原料。

多次洗涤：取适量脱毒后原料，按一定固液比取蒸馏水，将蒸馏水分3份，每次用一份蒸馏水与原料这个好混匀、滤去游离水，第3次洗涤时用氨水调节pH为4.8。

1.3.4 酶解方法

在三角瓶中加入10 g酶解原料配成50 g/L溶液，加入600 IU纤维素酶液与柠檬酸缓冲液，放入50 ℃恒温水浴摇床中，在pH 4.8、150 r/min条件下酶解60 h。反应结束后沸水中煮沸10 min离心，上清液经稀释后测定还原糖浓度[10]。

1.3.5 发酵条件

发酵温度28 ℃，pH 6.5，转速200 r/min；发酵培养基配方为：葡萄糖30 g/L、酵母粉3 g/L，K2HPO4·3H2O 0.075 g/L、MgSO4·7H2O 0.075 g/L、CaCl2·2H2O 0.025 g/L、KH2PO40.175 g/L，其他微量营养盐若干[11]。使用汽爆料酶解液提供50%配料用水，其余部分由自来水补足，葡萄糖含量不足部分由葡萄糖试剂补足。

1.3.6 检测方法

采用HPLC法测定葡萄糖、木糖含量；细胞数采用血球板计数；干物质质量浓度测定方法：取10 mL发酵液，离心后除去上清液，加蒸馏水至10 mL，再次离心，100 ℃下烘干藻泥，然后计算干质量。

1.3.7 数据分析方法

干物质质量浓度计算如式（1）[11]。

使用Origin 75进行数据分析。

2 结果与讨论

2.1 脱毒工艺优化

汽爆预处理后的原料中会产生乙酸、糠醛等毒性物质。在酶解发酵前应对汽爆处理后的物料进行脱毒处理，但脱毒的过程会导致酶解料成分变化、糖分损耗及设备投资增加及工艺的复杂性。因此，在酶解发酵前脱毒工艺的选择至关重要[12]。

2.1.1 不同脱毒方法对发酵液干物质质量浓度的影响

发酵液干物质质量浓度是发酵液及发酵液中细胞失去自由水以后的质量浓度，能够表示发酵液的生物量高低，代表发酵水平好坏。发酵液干物质质量浓度不仅能表明细胞数量、代谢产物的水平，还能表明细胞个体重量，从而更全面的表示发酵水平好坏。同样条件下发酵液干物质质量浓度越大则发酵液中细胞数量越多、单个细胞质量越大。

不同脱毒方法对发酵液干物质质量浓度的影响如图1所示，随着发酵时间的推移，各试验组的干物质质量浓度均不断增加，未添加汽爆料酶解液的对照组，发酵速度较快，干物质质量浓度增长迅速，在发酵第5天即达到最大干物质质量浓度（9.76 g/L）。未处理组发酵速度最慢，且在发酵第4天干物质质量浓度达到最大值（2.33 g/L），随后不断回落，可能是汽爆料酶解液中的糠醛、乙酸等有害物质含量过高抑制了异养小球藻的正常生长，且发酵后期藻细胞死亡、自溶，导致干物质质量浓度减少。其他3个试验组在发酵过程中干物质质量浓度也正常增长，但增长速度略低于对照组，水洗+滤液回收组发酵终了干物质质量浓度达到9.29 g/L，接近对照组，而水洗组和高温烘干组的发酵终了干物质质量浓度分别为8.71和7.25 g/L，说明水洗+滤液回收组脱毒处理最理想，高温烘干组则残留较多的有害物质。从发酵液干物质质量浓度评判，水洗+滤液回收组最佳，其次是水洗组，高温烘干组最差。

图1 不同脱毒方法对干物质质量浓度的影响

秸秆蒸汽爆破在破坏秸秆内部结构的同时，也导致秸秆中的木质素等物质在高温条件下产生了酸类、醛类、酚类等众多对微生物发酵有抑制作用的物质，因此没有进行脱毒的未处理组异养小球藻生长受到严重抑制。酸类、醛类等抑制物的沸点均介于60～138℃之间，能够在高温烘干条件下去除，但酚类抑制物的沸点普遍高于200 ℃难以被去除，因此高温烘干组虽然能够生长但生长情况低于其他处理组。酸类、酚类、醛类等抑制物均溶于水，水洗能够有效降低抑制物含量，从而有利于发酵的正常进行，因此水洗处理的发酵干物质质量浓度高于高温烘干组。水洗的同时会导致部分糖损失，而水洗+滤液回收则能够将损失在水洗液中的糖再利用起来的同时进一步降低酸类、醛类、酚类物质的抑制作用，从而使发酵结果更佳[3]。

2.1.2 不同脱毒方法对葡萄糖含量的影响

葡萄糖是异养小球藻能够直接利用的碳源，且利用效率最高。葡萄糖含量的变化能够反映异养小球藻生长和代谢情况。

不同脱毒方法对葡萄糖含量的影响如图2所示，随着发酵时间推移，葡萄糖含量不断降低，特别是对照组，葡萄糖含量降速最快，在发酵第5天，葡萄糖含量即降到0，说明对照组提供的发酵液环境最适合异养小球藻发酵，异养小球藻的生长、代谢均比较旺盛。水洗+滤液回收组次之，在发酵第6天，葡萄糖含量降到0。水洗组、高温烘干组则在发酵第5天后葡萄糖含量较低时消耗速度迅速放缓。而未处理组的葡萄糖含量一直处于缓慢下降过程中，在发酵进行到第4天以后，葡萄糖含量不再变化。

发酵初期除了未处理组外，其他试验组葡萄糖含量比较接近，说明未处理组中成分更为复杂，培养基在高温灭菌时受到美拉德反应更为明显。对照组没有受到任何抑制作用，因此在发酵第5天葡萄糖即消耗完毕，未脱毒处理组葡萄糖消耗非常缓慢，说明未处理组提供的发酵液环境中残留的抑制物质过多，影响异养小球藻的正常生长和代谢，在发酵后期由于异养小球藻细胞酶活性衰竭、生长代谢停滞，导致葡萄糖不再消耗，葡萄糖含量不再变化。所有脱毒处理组与对照组相比，葡萄糖消耗均有一定的延后，说明使用脱毒处理并没有完全消除抑制物的影响，不同的脱毒工艺酸类、酚类、醛类等抑制物质残留程度不同导致葡萄糖消耗速度不同，在发酵结束时高温烘干组在所有脱毒处理组中葡萄糖残留最多，其次是水洗组，水洗+滤液回收组葡萄糖消耗完毕，试验结果与发酵干物质质量浓度结果互相印证，说明水洗+滤液回收组更有利于发酵进行[13]。

图2 不同脱毒方法对葡萄糖含量的影响

2.1.3 不同脱毒方法对pH的影响

pH反映发酵液中微生物细胞的生长环境，以及微生物细胞的代谢水平。异养小球藻发酵过程产酸，正常发酵过程pH不断降低，而到发酵末期，由于细胞营养物质跟不上，藻细胞衰老、自溶，从而导致pH上升。另外，发酵过程中如果溶氧过低、渗透压过大等影响藻细胞正常生长、代谢的因素均会导致藻细胞死亡、pH上升。

不同脱毒方法对发酵液pH的影响如图3所示，随着发酵时间的推移，未处理组的pH不断上升，说明未处理组的发酵液环境不适宜异养小球藻生长，在发酵过程中不断有藻细胞死亡从而导致pH不断上升，而其他试验组的pH开始不断下降，说明藻细胞在代谢过程中不断产酸，藻细胞生长代谢正常，而在发酵末期，由于细胞老化，藻细胞死亡数量过多，导致pH上升。在发酵初期，对照组的pH最高，未处理组的pH最低，这可能是汽爆料中乙酸等物质影响了发酵液的pH。

结合图1～图3，水洗+滤液回收组的发酵过程和结果最接近对照组，其次是水洗组，未处理组则不能提供适合异养小球藻生长、代谢的环境。但水洗+滤液回收组处理滤液需要使用沸石粉，沸石粉虽然能够吸附糠醛等醛类抑制物，但不能有效吸附乙酸等有机酸类抑制物，而且在使用过程中又有部分吸附的抑制物返回到汽爆料浆中，而从发酵液干物质质量浓度来看，水洗+滤液回收组仅比比水洗组高0.58 g/L，增加幅度不大，却需要消耗新的原料，因此，选择使用水洗处理汽爆料。

图3 不同脱毒方法对pH的影响

2.2 洗涤工艺优化

水洗能够降低酸类、酚类、醛类等发酵抑制物，但同时水洗还需要消耗大量的水资源，水洗之后产生的废液也会造成明显的环保压力和成本压力，因此优化洗涤工艺有助于提高产量、减少成本。在相同用水量（m（秸秆）∶m（水）=1∶7.5）条件下，开展单次洗涤和多次洗涤对异养小球藻发酵结果影响的研究，结果见图4。

图4和图5分别是不同洗涤方法和不同用水量对干物质质量浓度的影响。随着用水量增加，发酵终了干物质质量浓度也不断增加，用水量（m（秸秆）∶m（水）=1∶7.5）1∶7.5试验组比1∶5试验组提高5.44%，而用水量（m（秸秆）∶m（水）=1∶7.5）1∶9试验组比1∶7.5试验组提高2.36%，干物质质量浓度增加比率下降明显。用水量（m（秸秆）∶m（水）=1∶7.5）1∶9试验组发酵终了干物质质量浓度达到9.53 g/L接近于对照组的9.76 g/L，说明多次洗涤、用水量（m（秸秆）∶m（水）=1∶9）能够满足需要。

图4是不同洗涤方法对干物质质量浓度的影响，单次洗涤试验组和多次洗涤试验组发酵终了干物质质量浓度分别为8.7和9.31 g/L，多次洗涤试验组比单次洗涤提高6.89%。多次洗涤可提高水资源利用效率。

图4 不同洗涤方法对干物质质量浓度的影响

图5 不同用水量对干物质质量浓度的影响

3 小结

使用不同脱毒方法处理汽爆料，结果发现使用水洗脱毒法处理汽爆料发酵终了干物质质量浓度比对照组低10.76%，使用水洗脱毒法处理汽爆料对异养小球藻正常生长、代谢没有太大影响，进一步优化洗涤工艺，结果发现，使用多次洗涤、用水量（m（秸秆）∶m（水）=1∶9），发酵终了干物质质量浓度达到9.53 g/L，仅比对照组低2.41%，能够满足需要。水洗脱毒法处理汽爆料工艺简单、操作步骤少，适宜于规模化生产使用。