桑葚花青素超声波辅助提取工艺优化

卫春会，张兰兰，邓杰，任志强，徐升东，程铁辕

1. 四川轻化工大学酿酒生物技术及应用四川省重点实验室（宜宾 644000）；2. 四川省阆州圣果酒业有限公司（阆中 637400）；3. 宜宾海关（宜宾 644000）

桑葚（mulberry）又名桑果、乌葚、桑椹等，含有丰富的营养物质，被誉为“21世纪最佳保健果品”，具有滋阴补血、生津止渴、补肝益肾等功效[1-3]。桑葚果实味甜汁多，色泽艳丽，富含黄酮醇、花青素、维生素、胡萝卜素、酚酸等多种生物活性物质，具有良好的保健功能[4-5]。花青素（anthocyanidin）是桑葚中主要的生物活性物质，是一种天然色素，具有抗氧化、抗癌、降血糖、预防心血管疾病、减少脂肪生成等多种生理活性功能[6-14]。近年来，花青素在食品、药品、保健食品领域方面应用广泛，作为天然食源性防腐剂，主要用于延长食品保质期；作为食品调料，被广泛用于各种日常食品如奶酪、饮料、酒等[15-17]。

近年来，花青素因与人体健康有着密切关系而广受关注，国内外对桑葚花青素的提取及用处有了不少研究。花青素提取纯化方法直接影响其研究及利用，目前花青素提取方法有超声波提取法、微波提取法、溶有机溶剂提取法、超临界流体萃取等[18]。江岩[19]利用溶剂浸提法从新疆药桑椹中提取花青素，得到最佳工艺。Rodrigues等[20]采用响应面法对巴西嘉宝果皮的超声辅助提取工艺进行优化。侯巧芝等[21]利用超声波辅助提取法从甘蔗皮中提取花青素并对其抗氧化活性进行研究。

此次试验以桑果干为研究对象，采用超声波辅助提取法提取桑葚花青素，超声波可以加速植物细胞壁的破坏而提高胞内物质提取得率，缩短提取时间[22]。通过探究不同的超声功率、超声时间、超声温度和料液比4个因素，确定较优工艺提取条件。此次试验结果有助于提高花青素提取量，并为进一步利用和开发桑葚提供理论和数据的支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

桑果干，来自四川省阆州圣果酒业有限公司。

1.1.2 主要试剂

95%乙醇、浓盐酸、氯化钾等均为分析纯，购自成都科龙化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

酶标仪（1500型），赛默飞世尔科技有限公司；紫外可见分光光度计（UV-1200型），上海舜宇恒平科学仪器有限公司；pH计（Starter2100型），奥豪斯仪器（上海）有限公司；粉碎机（BM255C型），广东美的精品电器制造有限公司；干燥箱（LabServ.LS.0610型），飞世尔试验器材（上海）有限公司；电子天平（AR2140型），梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；旋转蒸发仪（RE-5203型），上海亚荣生化仪器厂；数控超声波清洗器（KQ5200DB型），昆山市超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 预处理

将桑果干置于烘箱中，在50 ℃下将桑果干烘干1 h，再使用粉碎机将其粉碎成粉末状，得到桑葚粉末，过20目筛，放于干燥器密封储藏，备用。

1.3.2 缓冲液的配制

pH 1.0缓冲液配制[23]：0.2 mol/L KCl和0.2 mol/L HCl的体积比为25∶67。

pH 4.5缓冲液配制：配制0.2 mol/L NaAc溶液，使用0.2 mol/L HCl调至pH 4.5±0.1。

1.3.3 测量其最大吸收波长

称取5.0 g粉碎后的桑葚粉，用10 mL 50%乙醇浸提15 min，抽滤后得到花青素粗提取液。取5 mL花青素提取液，分别用pH 1.0氯化钾缓冲液和pH 4.5醋酸钠缓冲液稀释10倍，将稀释液静置15 min，用酶标仪在440～600 nm波长范围内分别测定2种提取稀释液，从440 nm开始的吸光度A，波峰处的波长为最大吸收波长，此处吸光度即Amax。

1.3.4 吸光度A及样品花青素含量C的测定

花青素的含量测定采用pH示差法[24]。

式中：A为总吸光度；Amax为最大吸收波长的吸光度；A700为波长为700 cm的吸光度；ε为Cy-3-gLu的消光系数，其值为26 900 L·mol-1·cm-1；MW为Cy-3-Glu相对分子质量，其值为449.2 g/mol；DF为稀释倍数；V为总取液体积，mL；Mt为样品质量，g；L为光程，其值为1 cm。

1.3.5 工艺流程

桑葚果干→粉碎→过筛→超声波辅助法→抽滤→取样测定吸光度→计算含量→旋转浓缩→冷冻干燥→花青素

1.4 超声波辅助法提取桑葚花青素的单因素试验设计

在前期的研究结果中，确定工艺条件：乙醇体积分数65%、pH 4[25]。称取若干份1.0 g桑葚粉置于250 mL三角瓶中，分别在一定条件下，考察超声功率、超声时间、超声温度、料液比4个因素对花青素提取量的影响。

1.4.1 料液比对桑葚花青素提取量的影响

在超声温度40 ℃、超声功率1 600 W、超声时间20 min、乙醇体积分数65%、pH 4的条件下，考察料液比1∶10，1∶20，1∶30和1∶40（g/mL）对桑葚花青素提取量的影响。

1.4.2 不同超声波功率对桑葚花青素提取量的影响

在超声温度40 ℃、超声时间20 min、料液比1∶20（g/mL）、乙醇体积分数65%、pH 4的条件下，考察超声波功率800，1 200，1 600和2 000 W对桑葚花青素提取量的影响。

1.4.3 不同超声波温度对桑葚花青素提取量的影响

在超声功率1 600 W、超声时间20 min、料液比1∶20（g/mL）、乙醇体积分数65%、pH 4的条件下，考察超声温度40，50，60和70 ℃对桑葚花青素提取量的影响。

1.4.4 超声时间对桑葚花青素提取量的影响

在超声温度40 ℃、超声功率1 600 W、料液比1∶20（g/mL）、乙醇体积分数65%、pH 4的条件下，考察超声时间10，20，30和40 min对桑葚花青素提取量的影响。

1.5 正交试验设计

依据单因素试验的结果，选取4个单因素合适的3个水平对桑葚花青素超声辅助提取工艺条件进行优化。选择超声功率、超声时间、料液比为变量，增加空白项，以桑葚花青素提取量为评价指标，每组3个平行，设计四因素三水平L9(34)的正交试验，从而确定提取桑葚花青素最佳工艺条件。

2 结果与分析

2.1 花青素最大吸收波长的确定

基于之前对桑葚花青素乙醇浸提工艺优化试验的研究，确定2条折线均在波长530 nm处出现波峰，吸光度达到最大，结果如图1所示。因此，此次试验选择采用波长530 nm以测定提取液的吸光度，并通过pH示差法计算桑葚花青素样品的吸光度与花青素含量。

2.2 单因素条件对桑葚花青素含量的影响

2.2.1 料液比对桑葚花青素提取量的影响

如图2所示，随着料液比的增加，花青素提取量呈现先增后降的趋势，当料液比为1∶20（g/mL）时，花青素提取量达到最大值。这是由于随着料液比的增加，溶液与花青素接触面积越大，花青素进入溶液量越多，得率越高[26]。因此，选择料液比1∶20（g/mL）。

图1 桑葚花青素最大吸收波长测定曲线

图2 不同料液比对花青素提取量的影响

2.2.2 超声波功率对桑葚花青素提取量的影响

如图3所示，超声波功率在800～1 600 W之间，桑葚中花青素提取量先缓慢降低再增加，当超声功率为1 600 W时，提取量达到最大，继续增加超声功率，提取量减小。这是因为超声波破坏了花青素结构，导致花青素提取减少[27]。故试验选择超声波功率1 600 W。

图3 不同超声波功率对花青素提取量的影响

2.2.3 超声温度对桑葚花青素提取量的影响

如图4所示，随着超声波温度的增加，花青素提取量增加，当超声温度达到50 ℃时，花青素含量达到最大值，这是因为随着超声温度的升高，细胞膜的透性增强，这有利于花青素的浸出[28]。但是，温度继续升高，花青素提取量降低，主要是因为高温容易导致花青素被氧化或降解[29]。因此，选择最佳超声温度50 ℃。

2.2.4 超声时间对桑葚花青素提取量的影响

如图5所示，随着超声时间的增加，桑葚花青素的提取量先增后降，当超声时间达到20 min时，花青素含量达到最大值，这是因为体系中存在浓度差，花青素溶出速度快。继续增加超声时间，花青素提取量下降，影响原因在于花青素本身易被氧化，超声时间较长会造成析出花青素被氧化[30]。因此，选择超声时间20 min。

图4 不同超声温度对花青素提取量的影响

图5 不同超声时间对花青素提取量的影响

2.3 桑葚花青素提取正交试验及结果

通过对超声功率、超声温度、超声时间、料液比4个因素进行单因素试验，初步揭示这些因素对桑葚花青素提取量的影响。对比单因素试验结果，桑葚花青素提取量随超声功率、超声时间、料液比3个因素变化的趋势较为明显。因此选择超声功率（A）、超声时间（B）、料液比（C）为变量。

在超声温度50 ℃的条件下，以桑葚花青素提取量为评价指标，设定四因素三水平L9(34)正交试验，正交试验结果见表1。为进一步确认各试验因素的可信度，对桑葚花青素提取的正交试验结果进行了方差分析，结果见表2。

由表1可知，根据极差值得到变量对花青素提取量高低的影响顺序为超声时间（B）＞超声功率（A）＞料液比（C）；通过极差分析得到桑葚花青素提取量的最佳工艺条件组合为A2B2C1，即超声时间为20 min、超声功率为1 600 W、料液比为1∶10（g/mL）。由表2可知，超声时间对试验结果有显著影响（p＜0.05）。超声功率与料液比对试验结果无明显影响（p＞0.05）。

2.4 工艺验证

由于直观分析得到的最优工艺条件为A3B2C1，花青素含量为2.80 mg/g，故对上述正交试验的最佳工艺条件A2B2C1进行工艺验证试验，在超声温度50 ℃的条件下，进行5组平行试验，结果如表3所示。结果显示，正交试验最佳工艺提取的桑葚花青素含量为2.88 mg/g，故最佳提取条件组合为A2B2C1，即超声功率为1 600 W、超声时间为20 min、料液比1∶10（g/mL）。

表1 超声波辅助法提取正交表

表2 超声波辅助法提取方差分析表

表3 超声波辅助提取法验证试验结果

3 结论

单因素试验和正交试验表明，超声功率、超声时间、料液比3个因素对桑葚花青素的提取量影响较大，其中超声时间对花青素提取量最为显著（p＜0.05）。根据桑葚花青素正交试验极差大小得到各因素对花青素提取量的影响：超声时间＞超声功率＞料液比。综合分析，最优工艺组合为A2B2C1，即超声时间为20 min、超声功率为1 600 W、料液比为1∶10（g/mL）。在此条件下，桑葚花青素提取量为2.88 mg/g。

采用超声波辅助提取法，提取量相对较高，操作简单易于控制，且提取时间短，节能环保，在实验室与工业生产上均可推行，是一种很具有应用前景的花青素提取方法。此次试验确定了超声波辅助法提取桑葚花青素的工艺条件，该工艺条件后续将对桑葚花青素纯化进行研究，为桑葚花青素的工业生产提供技术支撑。