SIRT3基因在老年膀胱癌组织中表达及对上皮间质转化的影响

蔡波 邢钱伟 管杨波 吴优 郭新

(南通大学附属医院泌尿外科，江苏 南通 226001)

膀胱癌是一类病因多且复杂、发病率较高的泌尿系统恶性肿瘤，大部分膀胱癌患者最初明确诊断时多为分化良好或中等分化的表浅性膀胱尿路上皮癌，采取手术治疗预后较好〔1〕。但由于膀胱尿路上皮癌细胞增殖和浸润易发生浸润性或转移性膀胱癌，给临床治疗带来巨大挑战，特别是老年患者由于上皮细胞分化低下而5年生存率更低〔2〕。肿瘤增殖、侵袭和转移能力涉及多种作用机制，研究已证实上皮间质转化(EMT)是该生物学行为中胚胎发育关键程序〔3〕。E-钙黏素(E-cadherin)缺失被认为是EMT发生一个重要标志，而Snail、Slug为E-cadherin主要抑制因子，可通过下调E-cadherin表达而诱导EMT发生和肿瘤生物学行为改变。沉默信息调节因子家族(Sirtuins)可调控衰老和肿瘤发生和发展，其中以SIRT3基因变化最为敏感。研究显示，结直肠癌细胞中SIRT3表达显著低于癌旁正常组织，且低表达组总生存期(OS)、无进展生存时间(PFS)缩短〔4〕。而另有研究表明肝癌、成纤维细胞肿瘤中SIRT3表达较低，且敲除SIRT3后可显著抑制肿瘤发生和发展〔5〕。参阅国内外报道和文献，SIRT3在膀胱癌中的表达及其影响机制尚存在争议。因此本研究从分子水平上探讨老年膀胱癌组织中SIRT3的表达及其与EMT的关系。

1 材料与方法

1.1临床材料与组织标本 经病理档案室收集2016年6月至2019年6月南通大学附属医院行手术切除的膀胱癌组织标本及配对癌旁正常组织108例，获取术中组织液氮冷冻后放入-80℃保存，记录围术期临床资料。纳入标准：①参照相关诊断共识〔6〕，由主任医师根据病灶处黏膜组织活检术确诊为膀胱癌；②参照TNM分期系统进行肿瘤分期；③年龄65～85岁；④首次确诊，既往未进行过放化疗；⑤不合并其他恶性肿瘤；⑥入院前半个月无严重急性感染病史。排除标准：①合并心、肝、肾等严重内外科疾病者；②标本保存不正确；③依从性特别差或中途要求退出的受试者；④临床资料不完整，相关检查不完善。男77例、女31例，年龄65～79岁，中位年龄75岁，<75岁47例、≥75岁61例，体重指数(BMI)<18.5 kg/m250例、≥18.5 kg/m258例，肿瘤直径≤5 cm 62例、>5 cm 46例，Ⅰ～Ⅱ期49例、Ⅲ～Ⅳ期59例，有淋巴结转移47例、无淋巴结转移61例，低分化56例、高中分化52例。

1.2细胞株与重组慢病毒转染细胞 30株人膀胱癌UMUC3-141细胞购自上海北诺生物科技有限公司，研究获得医学伦理会批准，实验符合癌细胞处理和使用相关规定。进行原代培养，取其对数生长期的细胞，接种于6孔细胞培养板中(5×104个/孔)；用含10%胎牛血清的DMEM培养液，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，细胞贴壁后换液；待细胞融合度达到70%～80%，换无血清的培养基同步化24 h，按照Lipofectamine 2000转染说明书进行转染；将人膀胱癌UMUC3-141细胞分为空白组(不作任何处理)、对照组(转染空白SIRT3质粒pGenesil2-Sirt3-shRNA)、SIRT3组(转染SIRT3质粒pcDNA3.1-Sirt3)各10株：转染72 h后，倒置荧光显微镜下观察转染效果，绿色荧光细胞所占百分比>80%表示转染成功可进行后续实验。

1.3实验试剂和仪器 试剂：总RNA提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)，反转录试剂盒(美国Takara公司)，RIPA蛋白裂解液(四川讯麦科技有限公司)，10%胎牛血清(吉泰生物有限公司)，DMEM培养液(广州威佳科技有限公司)，BCA试剂盒(泉州睿信生物科技有限公司)，ECL发光试剂盒(北京沃比森科技有限公司)，Lipofectamine 2000转染说明书(上海恒斐生物科技有限公司)，空白SIRT3质粒pGenesil2-Sirt3-shRNA、SIRT3质粒pcDNA3.1-Sirt3(上海钦诚生物技术服务有限公司)，磷酸盐缓冲液(PBS，杭州百思生物科技有限公司)，CCK-8溶液(长海李记生物科技有限公司)，Transwell小室(上海夏夷实业有限公司)，基质胶(北京生东科技有限公司)，4%多聚甲醛溶液(广州翔博生物科技有限公司)，苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(苏州泽科生物科技有限公司)，胰蛋白酶(上海源叶生物科技有限公司)，无血清培养基(北京奥博星生物技术有限责任公司)。仪器：DMi8倒置荧光显微镜(德国徕卡显微系统有限公司)、WJ-3-160T型CO2培养箱(上海新诺仪器设备有限公司)、实时荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)、MR-100酶标仪(杭州奥盛仪器有限公司)。

1.4方法

1.4.1免疫组化染色法 取癌细胞和癌旁细胞石蜡块，连续厚度为4 μm的切片，烤片4～5 h后脱蜡处理；将切片放入加热沸腾的含抗原修复液高压锅中进行高温修复，冷却后PBS冲洗3次；滴加3% H2O2100 μl，置入37℃孵育箱20 min，PBS冲洗3次；滴加10%山羊血清100 μl，室温孵育15～20 min；每张切片组织上快速均匀滴加一抗各100 μl，置于 37℃孵育箱1 h，PBS冲洗3次；孵育二抗，各滴加二抗100 μl，二氨基联苯胺(DAB)显色，显色好的切片反复冲洗，直至镜下观察细胞核变蓝；参考相关文献〔7〕计算阳性表达情况。

1.4.2Western印迹法 取癌细胞和癌旁细胞石蜡块，加蛋白裂解液、匀浆、离心，使用BCA试剂盒测定蛋白质浓度；取总蛋白上样，电泳、切胶、转膜、TBST封闭；加入SIRT3、E-cadherin、Snail、Slug一抗(1∶500)、GAPDH一抗(1∶2 000)，4℃冰箱过夜；TBST缓冲液漂洗，加山羊抗兔二抗抗，25℃摇床1 h；洗膜，使用ECL发光试剂盒曝光、显影；以GAPDH为内参蛋白，分析各条条带的灰度值(ECL发光试剂盒对PVDF膜进行曝光显影)，成像扫描分析系统测定内参和目的条带的灰度值。

1.4.3CCK8细胞增殖实验 传代培养3组UMUC3-141细胞，取生长状态良好的对数生长期细胞制成单细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中(2×103个/孔)；待细胞贴壁后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，于5%CO2、37℃的培养箱中培养180 min；AMR-100酶标仪测定12 h、24 h、36 h、48 h时450 nm波长处的光密度(OD)值，细胞增殖率= (研究组细胞OD/空白组细胞OD)×100%。

1.4.4Transwell小室实验 调整3组UMUC3-141细胞浓度至5×108/L，于Transwell小室上室中加入60 μl基质胶，下室中加600 μl含10%胎牛血清的DMEM培养液，于5%CO2、37℃培养箱中培养24 h；弃上室液体，4%多聚甲醛溶液固定15 min，HE染色试剂盒染色30 min，于倒置荧光显微镜下观察并计算穿过小室膜的平均细胞数，以此表示细胞侵袭能力。

1.4.5划痕实验 取3组UMUC3-141细胞，0.25%胰蛋白酶消化，吹打至细胞悬液，调整细胞浓度至2×108/L；接种于48孔板中，待细胞融合度达80%，用枪头沿着与皿底垂直方向划痕；PBS洗涤3次，加入无血清培养基，于5%CO2、37℃的培养箱中培养24 h，观察细胞迁移轨迹。

1.4.6Western印迹检测EMT调控因子表达量 取3组细胞，参照“1.4.2”进行Western印迹法检测，获得3组E-cadherin、Snail、Slug与β-actin的灰度值比值。

1.4.7免疫荧光法观察癌细胞形态变化 取3组细胞，冲洗、固定、风干，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30 min；滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；次日用PBST浸洗爬片3次，每次3 min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20～37℃孵育1 h，PBST浸洗切片3次，每次3 min；滴加DAPI避光孵育5 min，对标本进行染核，PBST 5 min、4次洗去多余DAPI；用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，获得荧光显微镜下癌细胞形态图像。

1.5观察指标 ①膀胱癌组织和癌旁正常组织中SIRT3及EMT标志基因E-cadherin、Snail、Slug表达水平，分析SIRT3与E-cadherin、Snail、Slug相关性；②膀胱癌组织和癌旁正常组织中SIRT3及EMT标志基因E-cadherin阳性表达率；③SIRT3表达与膀胱癌患者临床病理特征关系；④空白组(不作任何处理)、对照组(转染空白SIRT3质粒pGenesil2-Sirt3-shRNA)、SIRT3组(转染SIRT3质粒pcD-NA3-1-Sirt3)3组癌细胞增殖、侵袭、转移能力及E-cadherin、Snail、Slug表达量。

1.6统计学处理 采用SPSS23.0软件进行方差分析、t检验、χ2检验、相关性分析。

2 结 果

2.1不同组织的阳性率比较 SIRT3主要定位于膀胱癌细胞核或胞质中，呈蓝色颗粒，在膀胱癌中阴性表达；E-cadherin、Snail、Slug主要定位于细胞膜中，E-cadherin呈蓝色颗粒，Snail、Slug呈棕黄色颗粒。膀胱癌组织中SIRT3、E-cadherin表达明显低于癌旁正常组织(P<0.05)，Snail、Slug明显高于癌旁正常组织(P<0.05),见图1，表1。

图1 SIRT3、E-cadherin、Snail、Slug表达(DAB，×100)

表1 不同组织的阳性率对比

2.2不同组织蛋白相对表达量比较 膀胱癌组织中SIRT3、E-cadherin表达量明显低于癌旁正常组织(P<0.05)，Snail、Slug表达量明显高于癌旁正常组织(P<0.05)，见图2,表2。

2.3SIRT3与E-cadherin、Snail、Slug相关性 SIRT3与E-cadherin呈正相关(r=0.232,P=0.022),与Snail、Slug呈负相关(r=-0.553,P<0.001;r=-0.248,P=0.014)。

2.4SIRT3与膀胱癌患者临床病理特征的关系分析 性别、BMI、分化程度不同的膀胱癌患者，癌组织中SIRT3阳性表达率差异无统计学意义(P>0.05)；年龄≥75岁、肿瘤直径>5 cm、肿瘤分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移的膀胱癌患者SIRT3阳性表达率明显低于年龄<75岁、肿瘤直径≤5 cm、肿瘤分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移的膀胱癌患者SIRT3阳性表达率(P<0.05)，见表3。

图2 SIRT3、E-cadherin、Snail、Slug蛋白表达(Western印迹)

表2 不同组织蛋白相对表达量对比

表3 SIRT3阳性表达与膀胱癌患者临床病理特征的关系〔n(%)〕

2.53组UMUC3-141细胞增殖率分析 转染SIRT3后，UMUC3-141细胞增殖受到抑制；24 h、36 h、48 h时，SIRT3组UMUC3-141细胞增殖率明显低于对照组、空白组(P<0.05)，空白组和对照组差异无统计学意义(P>0.05)。SIRT3组UMUC3-141细胞增殖率随时间延长增殖率下降速度更显著(P<0.05)，见表4。

2.63组UMUC3-141细胞侵袭能力 空白组、对照组UMUC3-141细胞向器官表面靠拢，基底层可见较多伪足，形成的癌巢较大；SIRT3组UMUC3-141细胞较少，不见伪足或仅有少量伪足，未形成癌巢。见图3。转染SIRT3后，UMUC3-141细胞侵袭能力受到抑制；SIRT3组UMUC3-141细胞数(28.69±3.50)明显低于对照组(78.21±15.83)、空白组(75.05±16.04，P<0.05)，空白组和对照组差异无统计学意义(P>0.05)。

2.73组UMUC3-141细胞转移能力分析 空白组、SIRT3组UMUC3-141细胞在划痕48 h后逐渐愈合、划痕变小，SIRT3组UMUC3-141细胞在划痕48 h后未发生愈合、划痕甚至变大。见图4。转染SIRT3后，SIRT3组UMUC3-141细胞转移率(10.23±3.55)明显低于对照组(82.31±9.62)、空白组(83.68±9.35，P<0.05)，空白组和对照组差异无统计学意义(P>0.05)。

2.8SATB1过表达诱导膀胱癌细胞EMT发生 免疫荧光结果显示，空白组和对照组UMUC3-141细胞为卵圆形，转染SATB1后UMUC3-141细胞为长纺锤状、呈典型EMT形态学改变，见图5。

表4 3组转染后不同时间点UMUC3-141细胞增殖率比较

图3 3组UMUC3-141细胞侵袭能力(HE，×400)

图4 3组UMUC3-141细胞迁移能力(HE，×400)

图5 UMUC3-141细胞形态(DAPI染色，×400)

2.93组UMUC3-141标志基因蛋白组对表达量比较 转染SIRT3后，SIRT3组EMT标志基因蛋白E-cadherin升高而Snail、Slug表达下降；且SIRT3组E-cadherin明显高于对照组、空白组而Snail、Slug明显低于对照组、空白组(P<0.05)，空白组和对照组差异无统计学意义(P>0.05)，见表5，图6。

表5 三组UMUC3-141标志基因蛋白相对表达量比较

图6 转染SIRT3后各组SIRT3、E-cadherin、Snail、Slug表达(Western印迹)

3 讨 论

SIRT3基因自发现以来已被证实可参与多种肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移过程：孙军等〔8〕研究显示在非小细胞肺癌组织中SIRT3呈低表达，且低表达SIRT3组侵袭能力更高；李揽亚等〔9〕指出高表达SIRT3可抑制卵巢癌细胞增殖、迁移过程；Ma等〔10〕的体外实验结果显示，SIRT3在肾癌细胞中低表达，上调SIRT3表达可抑制癌细胞血管浸润和淋巴结转移，且预示着该病预后较好。本研究结果说明SIRT3下调可促进尿路上皮肿瘤发生。此时膀胱癌组织中EMT标志基因E-cadherin下降而Snail、Slug升高，Snail、Slug因子为上皮细胞标志性蛋白E-cadherin直接转录抑制因子，考虑EMT发生与SIRT3相关。相关性结果显示SIRT3与E-cadherin呈正相关而与Snail、Slug呈负相关，考虑SIRT3下调可诱导EMT发生，进而促进膀胱癌侵袭转移。

基于EMT发生途径，多项研究证实EMT为多种肿瘤原位侵袭和转移基础〔11，12〕。王路明等〔13〕发现补骨脂盼通过抑制 SIRT3通路,促进ROS产生,诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖和迁移,从而发挥抗口腔鳞状细胞癌作用。Li等〔14〕指出SIRT3可通过磷酸甲基化参与蛋白质转录、翻译过程，进而调控基因组织。SATBI可与尿路上皮膜上E-cadherin蛋白结合而发挥维持细胞间黏附状态作用。当机体被病毒、毒素等刺激时，SIRT3蛋白可大量缺失而抑制E-cadherin分泌，导致E-cadherin下调而其抑制因子Snail、Slug进一步高表达，加快EMT发生，进而促进癌细胞进展。相关研究证实了SIRT3蛋白和EMT通路之间的关系，提出SIRT3表达可抑制膀胱组织及肾组织上皮细胞EMT通路传导和转录〔15，16〕。本研究结果提示过表达SIRT3对促进癌细胞凋亡、而抑制癌细胞生长重要作用。这与既往报道结果相似，宋春丽等〔17〕分析SIRT3基因在肝癌细胞老化的作用，结果发现SIRT3基因过表达可以促进肝癌细胞衰老。Lee等〔18〕研究发现SIRT3过表达可以通过抑制Src/FAK信号通路达到抑制乳腺癌细胞的迁移的作用，从而降低癌细胞的侵袭和迁移能力。

综上所述，SIRT3在膀胱癌中呈低表达，低水平SIRT3可促进膀胱癌发生；过表达SIRT3可抑制EMT发生而抑制癌症发生和进展，有望成为膀胱癌转移和侵袭过程中的一种新的生物治疗靶点因子。但由于时间限制、样本量小，尚未明确膀胱癌中SATBI诱导细胞EMT的信号通路，仍需设计更为严密的、多中心、大样本、双盲的研究进一步分析相关机制。