去酰基化胃饥饿素对高脂饮食诱导C57BL/6J小鼠的抗疲劳作用

郭展宏 臧璞 郭青玉 杨翠华 邵加庆

(东部战区总医院内分泌科，江苏 南京 210002)

近年来随着饮食结构和生活节奏的改变，以肥胖为代表的代谢性疾病的发病率显著上升。过量摄入脂肪会导致肥胖和胰岛素抵抗，抑制骨骼肌蛋白质合成的上游信号传导，引起肌肉质量减少〔1〕。衰老和骨骼肌脂肪堆积也被认为对骨骼肌质量具有显著的负面影响〔2〕。动物研究发现高脂饮食(HFD)喂养的小鼠骨骼肌损伤后，后肢肌肉减少，肌纤维数量也随之减少〔3〕。此外，HFD亦可引起骨骼肌线粒体功能受损，导致运动能力下降和肌肉易疲劳〔4〕。肥胖所致抗疲劳能力的下降对机体健康和生活质量均产生明显负面影响。

胃饥饿素(Ghrelin)是胃底黏膜分泌的一种脑肠肽，在体内主要以去酰基化胃饥饿素(DAG)形式存在。Ghrelin可作用于体内诸多脏器并发挥广泛生理作用。近年研究发现ghrelin酰基化形式(AG)可通过激活乙酰辅酶A羧化酶促进骨骼肌细胞脂肪酸氧化〔5〕，抑制肌肉萎缩，改善老年性肌无力，且能够影响 运动耐力〔6，7〕。而DAG并不激活经典Ghrelin受体生长激素促泌剂受体(GHS-R)1a，对肌肉耐力的影响及机制尚不明确。本研究通过建立HFD诱导的小鼠肥胖模型，旨在探究DAG对肥胖小鼠抗疲劳能力的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组 C57BL/6小鼠36只(SPF，雄性，6周龄，购自南京大学动物实验中心)，饲养于屏障动物实验设施内(环境温度保持在22～24℃，相对湿度保持在50%～70%，12 h交替照明，自由进食水)，正式实验前适应性喂养1 w。36只小鼠随机平均分为3组：对照(NC)组、高脂(HFD)组、HFD+DAG组，每组12只。分别予以含10%脂肪和70%碳水化合物的标准饲料喂养(NC组)、含60%脂肪和20%碳水化合物的高脂饲料喂养(HFD组、HFD+DAG组)。三组小鼠分别给予每日腹腔注射生理盐水10 ml/kg(NC组，HFD组)、DAG0.8 mg/kg(HFD+DAG组)。DAG购自加拿大AnaSpec公司，标准饲料(D12450J)及高脂饲料(D12492)均购自美国Research Diets公司。

1.2小鼠跑步运动耐力实验 实验动物喂养15 w时使用电动跑台(ZH-PT型，安徽正华生物仪器设备有限公司)行力竭测试：所有小鼠连续3 d适应跑台，持续时间为10 min，速度为10 m/min，跑台倾斜10°。第4天时所有小鼠以初始速度10 m/min(10°坡度)在跑台上跑步，以0.5 m/min的速度加速至最高25 m/min。直到因小鼠力竭而终止实验，记录下跑步距离代表小鼠运动能力。小鼠力竭标准：在运动过程中，电刺激频率在4次/min以上，不能维持原强度运动，10 min短暂休息后，不能恢复运动能力且刺激驱赶无效，即判断为力竭。

1.3小鼠负重游泳实验 所有小鼠在喂养16 w后行负重游泳试验：称量小鼠，在鼠尾根部负荷10%体重的铅皮。随后放置于水深30 cm，水温25℃的水槽中，待小鼠沉入水底后将其及时捞出。记录小鼠自游泳开始至沉入水底的时间，作为小鼠游泳力竭时间。完成负重游泳试验后即处死小鼠，取出单侧腓肠肌及股四头肌并称重，计算腓肠肌或股四头肌指数=腓肠肌质量或股四头肌质量(g)/体重(g)。取血分离血清，检测小鼠血清乳酸脱氢酶(LDH)、乳酸(LA)、尿素氮(BUN)、肝糖原、肌糖原水平。LDH活性检测试剂盒(BC0680)、LA含量检测试剂盒(BC2235)、BUN含量检测试剂盒(BC1535)、糖原含量检测试剂盒(BC0345)均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.4统计学分析 应用SPSS23.0软件进行正态性及方差齐性检验、单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组小鼠体重与主要肌肉指数变化 实验于给药16 w后结束，实验期间各组小鼠体重均呈增长趋势见表1。自给药第2周开始，HFD组小鼠体重明显高于NC组(P<0.05)。与HFD组相比，HFD+DAG组小鼠体重未见明显差异(P>0.05)。给药16 w后，HFD组腓肠肌及股四头肌指数较NC组显著下降(P<0.05)；与HFD组相比，HFD+DAG组小鼠腓肠肌及股四头肌指数无明显差异(P>0.05)。见表2。

表1 各组不同时间小鼠体重比较

表2 各组腓肠肌及股四头肌指数比较

2.2各组跑台力竭运动距离与游泳力竭时间比较 与NC组相比，HFD组运动距离及游泳力竭时间明显缩短(P<0.01)；与HFD组相比，HFD+DAG组运动距离及游泳力竭时间显著延长(P<0.05)。见表3。

2.3各组BUN、LDH及LA水平比较 与NC组相比，HFD组血清BUN、LA显著升高，LDH显著下降(P<0.01)；与HFD组相比，HFD+DAG组BUN、LA均明显下降，LDH明显升高(P<0.05)。见表4。

表3 各组跑台力竭运动距离及游泳力竭时间比较

表4 各组血清生化指标比较

2.4各组肝糖原和肌糖原水平比较 与NC组相比，HFD组肝糖原和肌糖原含量均明显下降(P<0.01)；与HFD组相比，HFD+DAG组肝糖原和肌糖原含量均明显升高(P<0.01)。见表5。

表5 各组肝糖原和肌糖原水平比较

3 讨 论

研究表明肥胖可导致骨骼肌细胞线粒体功能受损、运动耐力下降〔8〕。运动耐力是对机体疲劳程度最客观直接的反映，在动物实验中电动跑台力竭测试和负重游泳试验是反映实验动物运动耐力和测试药物抗疲劳效果的有效手段〔9，10〕。本研究利用上述方法评估小鼠运动耐力发现相比NC组，HFD组小鼠体重显著上升，运动耐力明显降低，与既往研究一致〔11〕。

近年研究发现，Ghrelin可促进骨骼肌再生和卫星细胞自我更新，同时抑制骨骼肌活性氧自由基产生和炎症反应〔12〕。Mani等〔6〕发现运动引起的血浆总Ghrelin水平的增加与耐力呈正相关；与野生型同窝小鼠相比，Ghrelin受体基因敲除小鼠的力竭时间明显缩短。本研究显示长期应用DAG可明显增加肥胖小鼠的跑台力竭运动距离并延长游泳力竭时间，表明DAG对肥胖小鼠具有显著的抗疲劳作用。上述作用可能与DAG干预肌肉代谢有关，有研究发现DAG可通过激活肌管中的磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3Kβ)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体(mTORC)2及p38信号通路，抑制地塞米松诱导的骨骼肌萎缩〔13〕。此外，在Ghrelin受体基因敲除(Ghsr-/-)的小鼠中，DAG可诱导骨骼肌中丝氨酸/苏氨酸激酶(Akt)的磷酸化，改善禁食引起的肌萎缩〔13〕。由于DAG不能激活GHSR-1a，因而其抗疲劳作用发挥可能并不依赖于GHSR-1a受体途径，具体机制有待进一步探索。

在剧烈运动过程中，肌肉组织的主要供能方式由有氧氧化转变为无氧酵解，肌糖原被快速消耗并产生大量LA，并影响Ca2+的释放，从而抑制肌肉收缩能力并导致疲劳〔14〕。LDH可将LA中的氢解离重新还原成丙酮酸，从而缓解LA堆积。因此，小鼠运动能力与乳酸含量呈反比，而与LDH呈正比。本研究结果表明DAG干预可防止LA堆积并加速LA清除，同时升高LDH水平，发挥抗疲劳作用。BUN是蛋白质和氨基酸代谢的主要产物。随着运动强度和时间的增加，碳水化合物和脂肪所产生的能量不足以满足机体需求，随后蛋白质和氨基酸被分解供能导致BUN升高。BUN水平一定程度反映了机体疲劳状态。本研究表明DAG干预组小鼠血清BUN水平明显降低，疲劳状态得到缓解。

血糖、肝糖原和肌糖原是体内三大糖储备。长时间剧烈运动消耗血糖，糖原将成为重要供能物质。研究发现，肌糖原含量的增加可明显改善小鼠运动能力〔15〕。糖原含量亦可作为反映机体运动耐力的重要指标〔16〕。本研究结果表明DAG干预亦可通过增加机体糖原储备，提高运动耐力。

综上所述，应用DAG有助于提高肥胖小鼠的运动耐力和抗疲劳能力。同时，有研究显示DAG亦能够降低肥胖机体本身胰岛素抵抗及炎症状态〔12〕。本研究结果为提高肥胖患者运动效果与生活质量等提供了新的思路，然而DAG抗疲劳相关作用机制目前尚不明确，仍有待进一步研究。