慢性阻塞性肺疾病患者外周血单个核细胞对23价肺炎链球菌荚膜多糖疫苗的反应

王振国 黄译莹 涂常力 郑晓滨

(中山大学附属第五医院呼吸内科，广东 珠海 519000)

多年来，对肺炎球菌感染的控制主要着眼于早期诊断及抗生素治疗，这在一定程度上改善了疾病的预后，但未能减轻疾病造成的整体经济负担，并使得细菌耐药性增高〔1〕。近20年来，医学界认识到该病的控制需要一种能对公共卫生产生广泛影响的预防策略，并为达到这个目标而多方努力地寻找一种有效的抗肺炎链球菌疫苗〔2〕。慢性阻塞性肺疾病(COPD)是成年人最常见的慢性疾病之一，与肺部对有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关，致残率和病死率很高，将成为全球第3次致死病因，并且随着社会的老龄化及环境污染的加剧，COPD的患病率还将持续上升〔3～5〕。目前使用的 23 价肺炎球菌荚膜多糖疫苗(PPV23)是1983年批准上市的，建议用于高危成人及老年人。PPV23在高龄老年人及COPD病人中的临床有效性仍有争议，尽管大多数的病例对照及非直接队列研究均提示对侵袭性肺炎球菌病有一定的效果，前瞻性的临床试验及其 meta 分析均未能证明 PPV23在普通老年人及 COPD 病人中对肺炎球菌肺炎有显著的保护作用〔6～10〕。而循证医学协作组报告，虽 PPV23未能减少老年病人的肺炎发病率及相关性死亡，从观察性研究获得的证据表明 PPV23预防成人及非免疫缺陷老年人(≥65 岁)侵袭性肺炎球菌疾病(IPD)的有效性达 53%〔11〕。因此，Ochoa-Gondar 等〔9〕认为，接种PPV23在老年慢性肺病患者应答较差，有效性较低，但鉴于老年慢性肺病患者侵袭性肺炎球菌感染的后果及经济负担重，又缺乏更有效的疫苗，仍建议在这个人群中使用。由于 COPD 病人对PPV23免疫应答的现有研究结果不一致，本研究通过观察不同人群外周血单个核细胞(PBMC)对肺炎链球菌荚膜多糖反应，从而评估不同人群对PPV23主动免疫应答的真实情况。

1 资料与方法

1.1一般资料 以65岁为界分为老年及成人两个亚组。成人COPD组15例，来自中山大学附属第五医院呼吸内科门诊COPD稳定期患者，男9例，女6例，年龄35～52岁，平均(44.5±10.7)岁，符合中华医学会呼吸病协会制定的COPD诊断标准；老年COPD组15例，来自中山大学附属第五医院呼吸内科门诊COPD稳定期患者，男10例，女5例，年龄66～82岁，平均(72.3±6.2)岁，符合中华医学会呼吸病协会制定的COPD诊断标准；健康成人组15例，男8例，女7例，年龄23～48岁，平均(28.4±8.6)岁，为中山大学附属第五医院体检为健康者。健康老年组15例，男8例，女7例，年龄66～78岁，平均(68.8±5.6)岁。排除标准：患有其他肺部疾病，严重的心功能不全，慢性肝、肾疾病，恶性肿瘤，自身免疫性疾病，先天性或获得性免疫缺陷，接受系统性免疫调节或免疫抑制治疗(包括口服糖皮质激素)。无脾或脾切除术后。曾经注射过肺炎链球菌疫苗。近1个月内有感染性疾病病史。

1.2主要试剂及仪器 PPV23(纽莫法)(美国默沙东公司)；小牛血清(杭州四季清公司)；RPMI-1640(Gibco公司)；4-(2-羟乙基)-1哌嗪乙磺酸(HEPES)(MD公司)；淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)；电热恒温干燥箱(宁波市鄞州邱隘佳诺自动化仪表厂)；环氧乙烷灭菌锅(泉晖贸易国际有限公司)；XK97-2型双向恒温搅拌器(姜堰市新康医疗器械公司)；24孔培养板(美国Corning公司)；HERA Cell CO2培养箱(德国Heraeus公司)。

1.3实验方法

1.3.1PBMC的分离 ①所有受试者取外周静脉血10 ml，生理盐水10 ml稀释。②标记各离心管，向10 ml离心管中加入3 ml 淋巴细胞分离液，加入稀释后的静脉血。1 700 r/min离心20 min以分离细胞。③吸出PBMC及部分血清，置另一洁净离心管中。向离心管中加入6 ml NS液，混匀。1 000 r/min离心10 min 洗涤1次。倒置离心管，甩干上清，加入完全培养基1 ml吹打管底细胞混匀。

1.3.2PBMC的干预培养 ①PBMC加入24孔板。设干预组及对照组，各培养组均设3个复孔，每孔细胞悬液PBMC数为1.5×106个，体积为800 μl。②在含5%CO237℃培养箱培养24 h后，取上清液测抗肺炎链球菌荚膜多糖特异性免疫球蛋白(Ig)G、IgM抗体。并于抗原刺激孔添加稀释疫苗溶液200 μl(PPV23终浓度为0.115 μg/ml)，对照孔添加生理盐水200 μl，总体积均为1 ml，吹打混匀细胞悬液。在含5%CO237℃培养箱继续培养48 h，再取上清液测抗肺炎链球菌荚膜多糖特异性IgG、IgM抗体。

1.3.3间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测步骤〔12,13〕①包被：将11.5 μg/ml PPV23包被于聚苯乙烯ELISA板中，2孔加入不含疫苗的抗原稀释液作为背景孔(无抗原孔)，加盖封板膜，4℃冰箱过夜。②加实验室参考血清和待测样本：加入PBMC培养上清液及倍比稀释的实验室参考血清(8个浓度)，每孔50 μl，均设复孔,留2孔加入抗体稀释液(无血清孔)。于温育箱中37℃温育60 min。③加酶标工作液：加入稀释至工作浓度辣根过氧化酶标记羊抗人IgG或IgM或IgA，每孔100 μl，留2孔加入抗体稀释液(无二抗孔)。于37℃温育箱中温育60 min。④洗板：每次加洗涤液充分洗涤5次并充分拍板。⑤显色：每孔先加入显色剂 A 液(TMB) 50 μl，再加入显色剂 B 液(H2O2)50 μl，温育箱中温育30 min。⑥终止：取出酶标板，每孔加终止液50 μl，终止反应(颜色由蓝色立转黄色)。⑦酶标仪读值：终止反应后15 min在450和630 nm处的酶标仪双波长上读出反应孔的吸光度值。⑧计算：测定OD值=复孔算术平均值-最高空白对照值，最高空白对照值应控制在0.01以下。根据倍比稀释的实验室参考血清的浓度及对应的 OD 值，使用CURVEEXPERT软件来计算出标准曲线回归方程，再根据样本的 OD 值(取复孔平均值)，在回归方程上计算出对应的样品血清浓度与实验室参考血清抗体浓度的比值。

1.4统计学方法 采用SPSS19.0软件进行方差分析，两两比较采用LSD-t法。

2 结 果

2.1PBMC体外培养上清液抗肺炎链球菌荚膜多糖特异性抗体浓度(相对参考血清的抗体浓度比值×10-3) 4组PMBC在体外培养24 h后，疫苗干预前各组间抗肺炎链球菌荚膜多糖特异性抗体IgG、IgM的产生无显著差异(P>0.05)，见表1。

表1 疫苗刺激前各组抗体浓度的比较

2.2PPV23干预培养48 h后各组抗肺炎链球菌荚膜多糖特异性抗体浓度的比较(相对参考血清的抗体浓度比值×10-3) 加PPV23培养48 h后，对比疫苗刺激前，对照组及干预组各组的抗肺炎链球菌荚膜多糖特异性抗体均较前有下降。与对照组相比，疫苗刺激后4个干预组的抗肺炎链球菌荚膜多糖特异性抗体浓度均明显升高(P<0.05)。但是疫苗刺激后各分组间抗肺炎链球菌荚膜多糖特异性抗体IgG、IgM的产生无明显差异(P>0.05)。见表2。

表2 疫苗刺激后各组抗体浓度的比较

3 讨 论

肺炎链球菌感染是一个世界性问题，大于65 岁的老年人是罹病风险最高的人群之一，尤其是当患者合并有高危因素时。COPD 也是肺炎链球菌感染的常见高危因素。肺炎球菌荚膜多糖疫苗被建议用在老年人及COPD 病人，但其有效性一直存在争议。有关老年人及COPD 病人对疫苗应答差的原因，可能与免疫老化有关，并可能与机体老化过程中出现的免疫系统改变有关。临床上对COPD患者的常规治疗主要包括抗感染及解痉平喘氧疗等对症处理，随着肺炎链球菌耐药率的不断提高，COPD患者抗感染治疗的效果也不尽理想。为了减少COPD的急性发作，推荐对COPD患者进行常规PPV23接种〔14〕。国外报道指出，接种PPV23 COPD患者的死亡率、并发症、住院天数、发生呼吸衰竭的危险较低均较未接种者有下降〔15〕。

COPD患者多在40 岁以后出现症状。COPD 病人的主要呼吸生理改变也见于老年人，如小气道阻塞、肺弹性下降及动态过度膨胀，且COPD 的发病率随年纪而增加，提示机体老化可能是COPD 促进因素，或COPD 是机体加速老化的表现，与机体老化相关的免疫系统重塑在慢性炎症性疾病的发病中起重要的作用。有学者认为COPD 不过是外界毒性刺激物触发的加速的机体老化的一种表型〔16,17〕。有研究表明。随着年龄增长，老年人免疫反应有所下降。对比健康成年人，老年人对疫苗的免疫反应有一定程度的降低〔18〕。

抗体的产生需要许多的信号和最适的认知的相互作用，例如抗原提呈细胞、T细胞和B 细胞的受体参与。从外周血分离的PBMC是包含了这些细胞的。本研究结果显示，PPV23干预培养48 h后各组抗肺炎链球菌荚膜多糖特异性抗体浓度均较前有下降，考虑是随着体外培养的时间增加抗体代谢消耗所致。而经过PPV23刺激后，结果表明，人的PBMC仍有活力，可以继续分泌抗体。

血清的抗体水平并不能准确地代表最近免疫应答，由于以前对抗原的暴露，可产生可溶的抗体，血清的抗体水平包括这些累积的可溶的抗体。我们的方法取PBMC,检测其上清液分泌的抗体，更好地代表了宿主对疫苗的免疫应答。