老年胃癌患者胃癌组织中lncRNA H19和SIRT6表达及与预后的关系

韩海明 金伟 赵存新 史金胜 付金栋

(潍坊市益都中心医院 1消化内科，山东 潍坊 262500；2病理科；3日照市人民医院消化内科)

胃癌属于消化系统疾病，发病率居世界第四位，尤以东南亚和中国地区高发。在中国，胃癌的发病率在各种恶性肿瘤中占据首位，每年约有40万新增患者〔1〕。近几年来，胃癌患者的总体生存率明显改善，但是预后仍然不佳，5年生存率约为20%〔2〕。目前，筛查胃肠疾病最常用的方法是胃镜技术和组织学检查，但这些方法不仅成本高，而且侵入性大，通常给患者带来极大的痛苦。因此，寻找筛选诊断治疗胃癌的方法对胃癌临床治疗意义重大。长链非编码RNA(lncRNA)H19在膀胱癌、乳腺癌等多种肿瘤中的表达水平显著异常，但关于它在胃癌中的表达变化情况少有报道〔3〕。研究表明，沉默信号调节蛋白(SIRT)6在结肠癌组织中的表达比癌旁组织显著下调，能够作为诊断、治疗结肠癌的新靶标〔4〕。目前有关lncRNA H19和SIRT6在胃癌中组织中的表达及与胃癌预后相关研究较少，本实验初步探讨lncRNA H19和SIRT6在胃癌中的表达情况，并分析二者与临床病理特征及预后的关系，为胃癌的靶向治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料收集 收集2012年9月至2014年12月在潍坊市益教中心医院实施手术治疗的47例胃癌患者癌组织和癌旁组织(距胃癌组织3～5 cm)，平均年龄(62.39±7.63)岁；胃癌组织分期参照美国癌症联合委员会(AJCC)和国际抗癌联盟(UICC)2010年修订第七版的肿瘤淋巴结转移(TNM)分期标准〔5〕，其中Ⅰ期9例、Ⅱ期11例、Ⅲ期13例、Ⅳ期14例。根据世界卫生组织(WHO)(2000)病理组织学对肿瘤分化程度进行分类〔6〕，高分化(G1)18例，中分化(G2)19例，低分化(G3)10例。患者均符合胃癌疾病的诊断标准，术前均未接受放疗或化疗治疗，且资料完整，对此次研究知情，并签署知情同意书，同时排除患有其他恶性肿瘤的患者，且存在精神疾病或情绪不稳定无法配合者。同时选取同时期在医院体检的40例健康体检者为对照组男21例，女19例，平均年龄(61.41±7.53)岁。

1.2主要试剂 兔抗人SIRT6单克隆抗体购于美国 Cell Signaling Technology公司；通用型 SP 法免疫检测试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色盒均购于北京中杉金桥公司；TRIzol试剂盒、PCR引物均购于美国Invitrogen公司；SIRT6酶联免疫吸附试验(ELISA)测定试剂盒购于武汉Cusabio公司；过氧化氢、枸橼酸、二甲苯、无水乙醇等均为国产分析纯。

1.3qRT-PCR法检测lncRNA H19和SIRT6的表达水平 采用TRIzol试剂分别提取胃癌癌组织和癌旁组织的总RNA，经逆转录获得cDNA，以β-actin为内参，进行Real-time PCR检测。H19上游引物序列5′-GAACACCTTAGGCTGGTG-3′，下游引物序列5′-ATGTTGTGG-GTTCTGGGAG-3′；SIRT6上游引物序列5′-CCCGGATCAACGGCTCTATC-3′，下游引物序列5′-GCCTTCACCCTTTTGGGGG-3′；β-actin上游引物序列5′-GAGCTACGAGCTGCCTGA-C-3′，下游引物序列5′-GGTAGTTTCGTGGATGCCACA-3′。反应条件为：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，总共进行45个循环。

1.4免疫组化法检测SIRT6蛋白表达 取手术后经石蜡包埋的胃癌组织和癌旁组织切片(厚度4 μm)，将其分别于二甲苯、无水乙醇及磷酸盐缓冲液(PBS)中进行脱蜡处理，然后使用3%过氧化氢灭活内源性氧化酶后，取出切片并使用PBS溶液洗涤3次，每次5 min。使用微波修复法对抗原进行修复，将切片置于枸橼酸钠缓冲液(pH6.0)中，微波加热至沸腾后进行冷却，重复操作1次后用PBS清洗。清洗后取出切片，封闭10 min，加入SIRT6单克隆抗体，4 ℃孵育12 h。孵育后洗涤，先后滴加生物素标记的二抗和辣根酶标记链霉卵白素，4℃各孵育20 min。孵育后再次洗涤，加入DAB显色液染色5 min，之后经冲洗、复染、脱水、封片后置于显微镜下进行观察(×200)。从每个切片中选取5个高倍视野中随机挑选并对阳性染色细胞数量进行统计。(1)按细胞核的染色强度计分：无阳性着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；(2)按阳性细胞所占的百分比计分：小于5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。取上述两项结果的乘积：≤3分为阴性，>3分为阳性。

1.5ELISA检测血清中SIRT6蛋白水平 采集胃癌患者及对照组的静脉血5 ml。所有血样经分离得到血清低温保存备用。采用ELISA法对血清中SIRT6蛋白进行检测，操作过程严格按照试剂盒说明书进行。

1.6随访 对所有经治疗出院的胃癌患者进行复查或者电话随访，随访时间为3年，末次随访时间截止至2017年12月20日，死亡患者以死亡时间作为随访截止期。观察记录随访期间患者的生存情况。

1.7统计学分析 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析、两独立样本t检验、χ2检验。采用受试者工作特征(ROC)曲线评估lncRNA H19与SIRT6对胃癌的诊断价值；使用Kaplan-Meier方法计算胃癌患者存活率；采用Cox回归模型多因素分析、Pearson进行相关分析。

2 结 果

2.1lncRNA H19和SIRT6基因表达水平 与癌旁组相比，胃癌组H19表达水平明显增加(P<0.05)，SIRT6表达水平明显减少(P<0.001)，见表1。

表1 lncRNA H19和SIRT6表达水平(n=47)

2.2胃癌组织及癌旁组织中SIRT6蛋白表达 SIRT6蛋白阳性信号主要定位于细胞核。染色呈淡黄色、棕黄色(图1)。胃癌组织中SIRT6蛋白无表达或表达量较低，癌旁组织中SIRT6蛋白表达明显高于胃癌组织。与癌旁组织〔35例(74.47%)〕相比，胃癌组织中SIRT6阳性率明显降低〔21例(44.68%)；χ2=8.658，P=0.003〕。

2.3血清中SIRT6蛋白表达 与对照组〔(452.36±10.26)pg/ml〕相比，胃癌患者血清中SIRT6蛋白表达显著降低〔(349.27±9.73)pg/ml；t=48.034,P=0.000〕。

图1 胃癌组织及癌旁组织中SIRT6蛋白表达(DAB，×200)

2.4H19和SIRT6对胃癌诊断价值分析 通过ROC曲线评估H19和SIRT6对胃癌诊断价值结果显示，H19的ROC曲线下面积为0.773(95%CI0.676～0.871)，约登指数0.562，截断值为3.52；SIRT6的ROC曲线下面积为0.709(95%CI0.604～0.814)，约登指数0.478，截断值为0.76 pg/ml(图2、图3)。

图2 H19诊断胃癌的ROC曲线

图3 SIRT6诊断胃癌的ROC曲线

2.5H19和SIRT6基因在胃癌组织中的表达与临床特征关系 分别根据H19和SIRT6诊断胃癌的ROC曲线选取的截断值将47例胃癌患者分为高表达组和低表达组。H19和SIRT6表达水平与胃癌患者年龄、性别及肿瘤大小均无相关性(P>0.05)；H19和SIRT6表水平与肿瘤分期、分化程度、浸润深度及淋巴结是否转移显著相关(P<0.05)。见表2。

2.6H19和SIRT6表达水平相关性分析 胃癌组织中H19和SIRT6表达水平呈正相关(r=-0.583，P=0.015)。见图4。

2.7H19和SIRT6表达对胃癌患者生存期影响 H19高表达者3年生存率为42.3%显著低于低表达者62.5%(P<0.05)；SIRT6高表达者3年生存率为51.8%显著高于低表达者32.7%(P<0.05)。见图5、6。

表2 H19、SIRT6与胃癌临床病理特征的关系(n)

图4 H19和SIRT6表达水平相关性

图5 H19表达与胃癌生存期的关系

图6 SIRT6表达与胃癌生存期的关系

2.8胃癌患者预后的多因素分析 采用Cox回归模型分析显示，肿瘤分期、分化程度、浸润深度、淋巴结转移及H19和SIRT6表达是影响胃癌预后的独立因素(P<0.05)。见表3。

表3 Cox回归分析影响胃癌患者预后的因素

3 讨 论

胃癌是多种基因变化积累的结果，目前其发病机制还不十分明确。胃癌在发病初期没有较明显的特征表现出来，一旦检查确诊，其病情程度往往十分严重。不同地区、国家及不同人群之间，胃癌的发病率和死亡率差别较大，约70%的胃癌患者发生在发展中国家。我国胃癌发病率也较高，早期胃癌检出率约为10%〔7，8〕。由于目前针对此种疾病缺少敏感的筛查及早期诊断标准，因此研究出关于胃癌的关键性分析靶点及调控机制，可从根本上达到防治胃癌。

lncRNA是一种特殊的RNA分子，转录编码本大于200个核苷酸，不具有蛋白编码功能〔9〕。H19是一个编码2.3 kb的lncRNA，最早被熟知的印记基因之一，对任何蛋白质都不进行编码〔10〕。H19在不同癌症中表现出的作用不一样，既是抑癌基因，又是促癌基因〔11〕。在肝癌患者体内，H19通过促进miR-200s表达抑制癌细胞的迁移侵袭〔12〕。有研究报道称，H19与胃癌的发生发展关系密切，是胃癌重要的预后分子〔13〕。本研究结果表明，与癌旁组织相比，H19在胃癌组织中表达水平明显增加，并且高表达患者预后存活期明显低于低表达患者，同时H19在胃癌组织中表达水平与肿瘤分期、分化程度、浸润深度及淋巴结是否转移均具有相关性，与相关研究报道一致〔14〕。由此可以推测，H19在胃癌的发生发展过程中扮演着重要的角色，其表达水平影响胃癌预后，有可能成为诊断、治疗胃癌潜在的新靶点沉默信息调节因子(Sir)2是一种乙酰化酶，在生物体中广泛存在。SIRT6属于Sir2同源的蛋白质家族，但它乙酰化酶活性分场低，作用的底物也非常少〔15〕。SIRT6基因定位于人染色体19p13.3，全长8 000 bp以上，包括8个外显子，编码的蛋白质含有355个氨基酸残基〔16〕。SIRT6在生命体中的作用非常多，如维持基因稳定、延缓细胞衰老、抑制肿瘤等，这些功能可能与SIRT6同时具有的两种酶活性(去乙酰化酶活性和单ADP核糖基转移酶活性)相关。近年来，SIRT6在肿瘤中的作用越来越受到人们的关注。研究发现，SIRT6过表达能够激活具有激活活化型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)3蛋白的表达，促使肝癌细胞凋亡〔17〕。SIRT6 mRNA和其蛋白在髓母细胞瘤组织中表达出现异常，比癌旁组织显著下降，推测其可能在髓母细胞瘤中发挥抑癌作用。本研究结果表明，胃癌组织中SIRT6表达水平明显下调，且SIRT6低表达的患者预后存活期明显低于高表达患者，与H19表达水平相反，而相关研究报道称lncRNA H19对下游基因具有调控作用〔18〕，这提示胃癌组织中lncRNA H19可能通过某种途径对SIRT6进行调控，但是这一关系需要进一步研究证实。

综上所述，胃癌患者组织中lncRNA H19表达水平明显上调，SIRT6表达水平明显下调，且两者与临床病理特征及预后关系十分密切，有望成为诊治胃癌的新靶点。但由于此次研究的样本量较小，lncRNA H19和SIRT6在胃癌中的作用机制还不清，需要进行更加深入研究。