绿僵菌与3种杀虫剂混配对樟巢螟的协同作用

杨 华，赵丹阳，秦长生*

(1. 华南农业大学农学院，广州 510640；2. 广东省林业科学研究院/广东省森林培育与保护利用重点实验室，广州510520)

樟巢螟Orthagaachatin又称樟丛螟、樟叶瘤丛螟，属鳞翅目Lepidoptera螟蛾科Pyrdidae瘤丛螟属Orthaga，主要危害樟科Lauraceae植物，在广东省韶关市、肇庆市以及潮州市等多地造成严重危害(邱华龙等, 2016)。该虫以幼虫危害寄主植物叶片，1～2龄幼虫啃食叶片，2～3龄后开始吐丝结巢，将小树枝和叶片粘粘在一起，连同虫粪卷结在一起形成10～20 cm大小不等的鸟巢状的虫苞，在虫苞内取食嫩枝和嫩叶，发生严重时，整株叶片均可以被吃光，严重影响樟树的生长及美观(魏书军等, 2008; 赵丹阳等, 2016)。

目前对樟巢螟防治主要依赖于化学防治(张念环等, 2005; 杨晓娟等, 2006)，但化学防治会产生相应的“3R”问题。而绿僵菌、白僵菌等昆虫病原真菌可以主动侵入寄主体壁，分泌毒素致死寄主(徐金柱等, 2017)，并在体内迅速繁殖，使其发病迅猛，可在短期内有效遏制多种农林害虫种群数量增长；还能在寄主缺乏的情况下宿存于土壤中，在适宜条件下能随虫口的增加而大量繁殖，与害虫的发生保持较好的一致性，能起到对害虫持续控制的作用(Yangetal., 2019)。

本项目选用3株绿僵菌(Ma09、3297和Mf985)、1株白僵菌(GDLY9)及3种高效低毒杀虫剂(苯氧威、除虫脲和短稳杆菌)对樟巢螟低龄幼虫进行了毒力测定，并测定了金龟子绿僵菌Ma09和3种杀虫剂混配对樟巢螟低龄幼虫的协同作用，以期筛选出更为安全、低毒、高效的樟巢螟防治药剂，为樟巢螟的防治提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试药剂

供试菌株：蚱蜢绿僵菌Mf985、金龟子绿僵菌Ma09、金龟子绿僵菌3297及球孢白僵菌GDLY9。菌株由广东省森林培育与保护利用重点实验室保存，绿僵菌孢子粉含孢量约为3×109孢子/g，白僵菌含孢量约为5×109孢子/g，含水量小于5%。

供试药剂：苯氧威(3%乳油，河南省郑州市沙隆达伟新农药有限公司)、除虫脲(20%悬浮剂，河南省安阳市安林生物化工责任有限公司)、短稳杆菌Empedobacterbrevis(100亿孢子/ml悬浮剂，镇江市润宇生物科技开发有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1绿僵菌、白僵菌以及3 种杀虫剂对樟巢螟低龄幼虫的毒力

从林间采集樟巢螟虫苞带回实验室，用细毛笔挑取健康活泼的2～3龄幼虫作为供试昆虫。将幼虫置于15 cm培养皿中，底部铺有滤纸，以新鲜樟树叶片饲喂。分别将绿僵菌、白僵菌和3种杀虫剂配制成一定浓度的药液并按梯度进行稀释，采用Potter塔喷雾法，将装有幼虫的培养皿置于喷雾塔的载物台上，每次喷1 mL药剂到虫体上，将幼虫用细毛笔挑取后转移至养虫盒中饲养观察，统计每日死亡数。每个处理30头，3次重复，以0.1%吐温-80溶液为对照。

1.2.2绿僵菌与3种杀虫剂混配对樟巢螟低龄幼虫的毒力

选择金龟子绿僵菌Ma09分别与苯氧威、除虫脲和短稳杆菌进行混配并测定其协同增效作用。绿僵菌孢悬液配制成1×106孢子/mL的浓度，加入杀虫剂，使杀虫剂稀释浓度达到1 000倍，参照1.2进行樟巢螟低龄幼虫的毒力测定。同时分别测定单独使用绿僵菌和杀虫剂对低龄樟巢螟幼虫毒力。根据下列公式计算协同毒力指数(c.i)并将其作为评判两种药剂相互作用的依据，当c.i ≥ 20时为判定为增效作用，c.i ≤ -20时为拮抗作用，-20

1.3 数据处理与分析

所得数据用SPSS 20.0统计软件进行处理分析，采用Duncan氏新复极差测验进行差异显著性分析。并运用Probit机率值分析法求出毒力回归方程、半致死时间LT50、LT90、95%置信区间、卡方值、显著性等(贾春生, 2006)。

2 结果与分析

2.1 绿僵菌、白僵菌对樟巢螟低龄幼虫的毒力

不同浓度下，4种昆虫病原菌处理后，樟巢螟每日死亡情况(图1)。总体上，死亡高峰期基本在处理后的第3～4天，1×108孢子/mL浓度的孢子悬浮液处理后6 d之内樟巢螟全部死亡。低浓度的孢子悬浮液处理后，死亡持续时间较长，7～8 d之内仍有活虫，有些处理甚至持续至12 d。白僵菌GDLY9的效果要优于其他3种绿僵菌。基本上所有浓度处理后6 d之内樟巢螟全部死亡。

图1 樟巢螟在4种昆虫病原真菌不同浓度下日死亡情况Fig.1 Orthaga achatina larvae daily death of 4 entomopathogenic fungi at different concentrations

表1～表4展示了3种绿僵菌和1种白僵菌对低龄樟巢螟幼虫的毒力，回归分析表明，死亡率与时间呈线性相关，并且致死中时相随着孢子浓度的增大而降低。当孢子浓度达到108孢子/mL这一级别时，4种昆虫病原菌的致死中时均在3 d左右，分别为3.21、3.5、3.03、3.01 d。当孢子浓度为104孢子/mL这一级别时，4种病原菌的致死中时差异较大，分别为8.48、5.54、5.06和3.89 d，其种白僵菌GDLY9效果最好(LT50为5.06 d)，绿僵菌3297效果最差(LT50为8.48 d)。绿僵菌Mf985和Ma09效果相当，LT50均在5 d左右。

2.2 3种化学药剂对樟巢螟的毒力

处理24 h后，苯氧威和除虫脲的致死中浓度LC50分别为35.89和129.42 μg/mL，苯氧威的效果显著优于除虫脲；同样处理48 h后，苯氧威的LC50为13.67 μg/mL，LC90为35.53 μg/mL，均显著低于除虫脲(LC50为82.53 μg/mL，LC90为158.38 μg/mL)，说明苯氧威对樟巢螟低龄幼虫的防治效果要优于除虫脲(表5)。短稳杆菌对樟巢螟低龄幼虫也表现出了良好的致死作用(表6)，1×108孢子/mL浓度处理后的LT50和LT90分别为1.28、2.50 d，并且各个浓度在处理5 d后，死亡率均达到了100%。

表1 绿僵菌Mf985对樟巢螟幼虫的毒力

表2 绿僵菌Ma09对樟巢螟幼虫的毒力

表3 绿僵菌3297对樟巢螟幼虫的毒力

表4 白僵菌GDLY9对樟巢螟幼虫的毒力

表5 苯氧威和除虫脲对樟巢螟幼虫的毒力

表6 短稳杆菌对樟巢螟幼虫的毒力

2.3 绿僵菌与3种化学药剂混配对樟巢螟低龄幼虫的毒力

协同作用结果(表7)表明，混配剂中，绿僵菌Ma09与3种杀虫剂混配对樟巢螟2～3龄幼虫致死效果均比较好，混配后其校正死亡率分别为100%、85.78%和87.56%，绿僵菌与3种药剂混配后协同指数分别为20.43、27.52和33.13，均大于20，表现出增效作用，并且绿僵菌与苯氧威混配后对低龄樟巢螟幼虫的致死率达到了100%，防治效果明显。

表7 绿僵菌Ma09与3种杀虫剂混配对樟巢螟幼虫的增效作用

3 讨论与结论

绿僵菌能通过主动侵染寄主、穿透昆虫体壁致死寄主，其发病迅猛，可在短期内有效遏制害虫种群数量的急剧增加，将害虫控制在经济损害水平以下。据童应华等(2014)报道，绿僵菌Ma1291-2对樟巢螟具有较强的致病力，以点滴法将1.0×108孢子/mL的孢子悬液接到2～3龄幼虫的体表，LT50为6.29 d。本实验选用的几种昆虫病原菌对樟巢螟低龄幼虫均具有较强的致病力，1.0×108孢子/mL浓度处理的LT50在3～4 d之间。生物测定中不同的接种方式导致毒力测定结果差异较大，有时甚至无法比较(Wraightetal., 1998)。规范的生物测定方法要求真菌制剂的接种方式尽可能模拟自然侵染，利于田间应用，因此最好采用喷雾或者喷粉方式进行。此外不同的菌株之间毒力差异也比较大，大量的关于绿僵菌菌株筛选的研究表明 (臧欢等, 2013; 于浩海等, 2014; 刘晨等, 2014; 练涛等, 2019; 邓嘉茹等, 2020)，虽然不同的菌株对不同寄主显示出了显著的致病性差异，但筛选出的高致病力菌株的LT50都在2～8 d，利用绿僵菌、白僵菌等开展农林害虫的防治，菌株之间的差异具有较大利用空间，因此针对不同寄主进行菌株筛选是十分必要的。

细菌杀虫剂是另一种可利用的生物杀虫剂，刘树生(刘树生, 2009)利用8 000 IU/mg苏云金杆菌可湿性粉剂防治樟巢螟，7 d后防治效果达到92.28%，持效期长。关丽梅(关丽梅等, 2018)等人分离出来一株对樟巢螟具有较高毒力的致病性粘质沙雷氏菌(LS-1)，樟巢螟感染该菌后虫体发红、发黑，变软，部分甚至流出脓液，感染120 h后，校正死亡率为69.1%，说明该菌株对樟巢螟具有很强的致死作用。本实验中所使用的短稳杆菌是一种革兰氏阴性菌，源自田间自然感病的斜纹叶蛾Spodopteralitura幼虫(王以一等, 2014)，是多种鳞翅目害虫的重要细菌性致病菌(杨延芳等, 2016; 王义生等, 2018; 王迎春等, 2019)经大规模发酵而获得的产品，已在国内外多个地区进行了推广应用。本研究表明该菌对樟巢螟2～3龄幼虫也具有较高的致死性。各个浓度下致死中时在1～3 d，并且5 d后全部死亡。

昆虫生长调节剂针对昆虫特定生长时期，具有高度的选择性，对人和动物都是安全的，并且与传统杀虫剂机理不同，可以有效缓解因长时间大量使用传统杀虫剂带来的抗药性问题(何佳和蒋志胜, 2003)。苯氧威是一种非萜烯类氨基甲酸酯类化合物，具有胃毒和触杀作用，并对多种昆虫有保幼激素活性，可抑制幼虫蜕皮，无法发育成成虫(孙德莹等, 2006)。除虫脲是第1个苯甲酰苯脲类选择性杀虫剂，具有触杀和胃毒作用，是另一种昆虫生长调节剂类杀虫剂(Yaoetal., 2020)。二者虽然都在蜕皮过程中发挥作用，但是作用机制完全不同。苯氧威是一种非甾体保幼激素类似物，主要作用是阻止昆虫发育、抑制变态发生；而除虫脲属于几丁质合成抑制剂，可使昆虫表皮的几丁质合成过程受阻，沉积受抑制。也正是因为二者的作用机制不同，将其与绿僵菌混配后获得的作用效果亦不同(c.i苯氧威=20.43；c.i除虫脲=27.52)。绿僵菌分泌大量表皮降解酶降解体壁，打通侵入通道，从而成功侵入。而除虫脲恰恰抑制了昆虫体壁主要成分几丁质的合成，从而使得绿僵菌更加容易侵染，因此将绿僵菌与除虫脲混用后具有更好的增效作用。使用微生物杀虫剂和昆虫病原菌的混合后相比较化学杀虫剂对环境和天敌的影响更小。一般情况下，化学杀虫剂及其助剂等往往会对病原菌孢子造成伤害，但是同为生物源的昆虫病原细菌通常不会对真菌产生影响(Zouetal., 2013)，因此试验中所选用的绿僵菌与短稳杆菌混配后增效作用最好。

据调查樟巢螟在大部分地区1年发生2代，部分地区存在3代(樊敏等, 2006; 温小玲和吴希从, 2007)，第1代整齐，第2代有少数出现世代重叠现象，7～8月份幼虫和成虫同时出现。因此最佳防治时间应该为第1代幼虫为害期5～7月份。本实验所选用的几种药剂对樟巢螟2～3龄幼虫均有较好的致死效果。但是由于樟巢螟不同于其他鳞翅目害虫，其幼虫隐藏于虫苞中，因此林间防治的时候常规的喷雾方法有时候难以渗入虫苞中，可考虑将绿僵菌与3种杀虫剂混合其制成微胶囊粉剂，喷粉机喷施粉剂，操作简单，并且对环境要求低(杨华等, 2018)。大面积的林间生物防治技术的研发是下一步需要解决的问题，因此需要大量培养绿僵菌孢子粉，而本实验室已经形成了一套完整的金龟子绿僵菌Ma09中试生产工艺，可大量生产绿僵菌孢子粉。但是对于白僵菌还未形成完整的生产工艺。因此在药剂混配协同作用试验中选择金龟子绿僵菌Ma09而没有选择效果更好的白僵菌GDLY9。