荧光定量PCR 法检测丙肝病毒定量、分型的结果分析

赵亚娟 ，杜帅格 ，路琳君 ，刘玲

（1.平煤神马医疗集团总医院检验科，河南 平顶山 467000；2.平煤神马医疗集团总医院核医学科，河南 平顶山 467000）

丙型肝炎是一种由丙型肝炎病毒（HCV）感染引起的病毒性肝炎,随着病情发展可能引起慢性活动性肝炎,甚至进展为肝硬化[1]。有研究表明HCV是肝细胞癌的危险因素, 且丙肝病毒核酸定量(HC V-RNA)与患者预后密切相关[2]。目前,临床针对丙型肝炎患者主要的治疗方式是给予干扰素,但在治疗过程中需观察HCV-RNA 在血清中含量的变化,为病情评估提供依据,但有研究指出HCV-RNA 在血清内含量较低,认为观察HCV-RNA 在血清中含量的变化这种方法准确性欠佳[3]。荧光定量PCR 法（FQ-PCR） 在低水平核酸定量检测中表现出明显优势,这种检测方式污染率低,特异度高,能提高检测精准度,且容易标准化[4]。为寻找准确诊断HCV的方法, 本研究对FQ-PCR 法在HCV-RNA 定量、分型检测中的应用价值及与肝功能的相关性进行分析,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取 2018 年 4 月-2019 年 4 月于我院进行荧光定量PCR 法检测HCV-RNA 的患者560 例,其中 HCV-RNA 定量阳性 246 例,有基因分型检测记录的112 例,对患者临床资料进行回顾性分析。男 320 例,女 240 例,年龄 23～75 岁,平均 5 1.29±8.95 岁；体质指数 18.5～23.9kg/m2,平均 20.82±0.71kg/m2。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准 ⑴所有患者经FQ-PCR 法检测确诊为 HCV； ⑵抗 HCV 或 HCV-RNA 有 1 项呈阳性；⑶18～80 岁；⑷病例资料完整。

1.2.2 排除标准 ⑴心、脑、肺等重要脏器损害；⑵恶性肿瘤；⑶合并其他类型的肝炎,如乙型肝炎、甲型肝炎等；⑷自身免疫性疾病；⑸因精神或体质问题无法有效配合试验者。

1.3 方法

1.3.1 FQ-PCR 法检测主要仪器 SLAN-96P 型实时荧光定量PCR 扩增仪(上海宏石公司)、TGL-16g高速低温离心机（珠海黑马公司）；主要试剂包括上海科华生物药业股份有限公司提供的丙型肝炎病毒核酸测定试剂盒,泰普生物科学有限公司提供的丙型肝炎病毒基因分型试剂盒。⑴提取RNA：①取血清200μl,加入40ul 去抑制剂,充分混合后再加入200ul 裂解工作液, 振荡混匀后瞬时离心置70℃孵育 10min； ②瞬时离心后加入 220μl 无水乙醇,振荡混匀；③离心后将上述液体全部转移至放置专用离心柱的2ml 离心管中；③1100g 离心1min,弃离心管里的废液；④加入700μl 洗涤液A11 00g离心1min,弃去管内液体；⑤加入700μl 洗涤液B 1100g 离心1min, 弃废液后再2000g 离心 3min 将残液去除干净；⑥取出核酸取提柱,放入新的2ml离心管中, 加入50μl 洗脱液至取提柱膜面中央,静置1min 后离心,离心管中收集的液体即为PCR 反应模板。⑵加样：取配制好的HCV 反应液20μl,加入等体积待测模板,离心数秒后进行扩增。⑶扩增程序：①50℃25min；②94℃2min；③94℃10s,55℃15s,72℃15s,5 个循环； ④94℃10s,60℃45s,42 个循环；步骤4 中60℃采集荧光；⑤40℃30s 扩增结束。设定合适的基线和阈值线, 经软件自动分析出结果。结果判断 测定结果为0 （无数值） 的标本为HCV-RNA 阴性； 小于 1.0×103IU/ml 报告低于检测下限；103～107IU/ml 的样本按照测定结果直接报告。

1.3.2 肝功能指标 检测于入院当日采集3ml 空腹静脉血,3000r/min 离心5min,分离血清,测定并选取观察血清白蛋白(ALB)、丙氨酸氨基转移酶(ALT) 、总胆红素（TBIL）水平。主要仪器全自动生化分析仪为 ADVIA-2400。主要试剂包括 ALT、TBIL、ALB检测试剂盒均购自北京利德曼生化股份有限公司。ALT、TBIL、ALB 的参考区间分别为 0～40U/L、0～20umol/L、35～55g/L。

1.4 观察指标与评价方法 观察患者HCV-RNA定量与基因分型检测结果。于患者入院当日检测肝功能指标, 包括血清 ALB、ALT、TBIL 水平,以HCV-RNA 定量＜1.0×106IU/ml 为低病毒载量,以HCV-RNA 定量≥1.0×106IU/ml 为高病毒载量,比较不同病毒载量患者的肝功能指标。经Pearson 线性相关分析HCV-RNA 定量、 基因分型与丙型肝炎患者肝功能的相关性。⑴HCV-RNA 阳性评价：经FQ-PCR 法检测,主要仪器与试剂同上,由专业检测人员严格根据说明书完成操作,以HCV-RNA＞1.0×103IU/ml 视作阳性。⑵HCV-RNA 基因分型：严格按照试剂说明书操作提取RNA, 取各亚型反应液加入模板按说明书设定程序扩增, 以CT 值＜25.1 并呈典型S 型曲线为阳性判断样本的亚型。

1.5 统计学方法经SPSS20.0 软件处理数据,计量资料用表示,行 t 检验。经 Pearson 线性相关分析HCV-RNA 定量与肝功能的相关性,相关性系数r 越接近-1 或 1,提示相关性越强,P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 560 例患者HCV-RNA 定量检测结果分析 在560 例患者中,有 314 例（56.07%）患者 HCV-RNA定量检测呈阴性,246（43.93%）例呈阳性。见表1。

表1 560 例患者HCV-RNA 定量检测结果分析[n（%）]

2.2 HCV-RNA 定量阳性、阴性患者的肝功能指标比较 HCV-RNA 定量阳性患者血清ALB 水平显著低于 HCV-RNA 阴性的患者（P＜0.05）,且血清 A LT、TBIL 显著高于 HCV-RNA 阴性的患者 （P＜0.05）,见表 2。

表2 HCV-RNA 定量阳性、阴性患者的肝功能指标比较

表2 HCV-RNA 定量阳性、阴性患者的肝功能指标比较

HCV-RNA 定量（IU/ml） n ALB（g/L） ALT（U/L）TBIL（μmol/L）阴性阳性314 246 t P 29.83±4.61 24.94±3.25 14.114 0.000 38.51±4.76 55.74±6.19 37.237 0.000 15.31±2.15 25.62±3.78 40.665 0.000

2.3 HCV-RNA 阳性患者低病毒载量、高病毒载量的肝功能指标比较 以HCV-RNA 定量＜1.0×106IU/ml 为低病毒载量, 以 HCV-RNA 定量≥1.0×106IU/ml 为高病毒载量,结果显示,高病毒载量者的血清ALB 水平显著低于低病毒载量者,血清AL T、TBIL 显著高于低病毒载量者（P＜0.05）,见表 3。

2.4 HCV-RNA 定量与肝功能的相关性分析 经Pearson 线性相关分析提示 HCV-RNA 与血清ALT、TBIL 呈正相关（r=0.441、0.625,P＜0.05）,与 AL B 呈负相关（r=-0.774,P＜0.05）。

表3 HCV-RNA 阳性患者低病毒载量、高病毒载量的肝功能指标比较

表3 HCV-RNA 阳性患者低病毒载量、高病毒载量的肝功能指标比较

HCV-RNA 定量（IU/ml） n ALB（g/L） ALT（U/L）TBIL（μmol/L）低病毒载量高病毒载量138 108 t P 27.36±2.53 22.81±2.98 12.942 0.000 39.95±3.71 52.39±5.03 22.318 0.000 14.92±2.03 23.91±3.35 26.015 0.000

2.5 112 例患者基因分型检测结果及肝功能指标分析 在 112 例患者中,1b 型 83（74.11%）例,非 1b型 29 （25.89%） 例。1b 型与非 1b 型患者的血清ALB、ALT、TBIL 水平比较无显著差异 （P＞0.05）,见表4。

表4 HCV-RNA 定量与肝功能的相关性分析

表4 HCV-RNA 定量与肝功能的相关性分析

HCV-RNA 基因分型 n ALB（g/L） ALT（U/L）TBIL（μmol/L）1b 型非1b 型83 29 t P 28.33±4.76 27.19±4.03 1.153 0.252 47.15±4.13 45.59±5.07 1.648 0.102 21.59±4.54 23.47±4.48 1.926 0.057

3 讨论

目前, 临床针对HCV-RNA 的检测方法较多,但检测效果不尽相同,如分枝DNA(bDNA)技术操作简单、稳定性良好,但其定量范围、敏感度欠佳[5]。有研究表明HCV-RNA 在血清中表达量较少,且变化范围大,临床必须选择一种敏感度、特异度、准确率高的方式予以测定,提高检测效果[6]。有研究指出抗HCV 检测仅能反映既往感染或HCV 感染,无法完全作为丙型肝炎诊断的依据[7]。FQ-PCR 法弥补了传统检测方法的缺陷,能降低污染率,且操作简单,尤其适用于定量意义大的指标[8]。这种检测方式通过系统荧光曲线明确循环数量, 能确保PCR 反应呈对数期状态,提高检测结果的精准性[9]。

通过分析患者的HCV-RNA 基因分型,提示以1b 型居多,与既往研究结论基本吻合[10]。有学者发现HCV 病毒分型存在地域性特征,1a 型大多集中在欧美国家,1b、2a 型则集中于亚洲国家,4 型集中于中东、北非地区,这为本研究结论提供了理论支持[11-12]。本研究纳入的均为中国居民,基因分型以1b为主。我国关于HCV4 型的报道非常少见,在广东地区可能存在HCV4 型病例,原因在于该地区属于沿海开放城市,国际交流相对较多,经常出入外籍人士[13,14]。FQ-PCR 法可通过扩增特异性HCV 基因片段测定核苷酸序列,从而对HCV-RNA 基因分型进行检测, 容易实现HCV-RNA 检测的标准化,检测准确性较高。

肝功能损害在丙型肝炎患者中比较常见,血清ALB、ALT、TBIL 水平是评估肝功能受损程度的重要指标。研究发现在丙型肝炎患者中,血清 ALB 减低较为常见,且患者血清 ALT、TBIL 水平均高于正常人[15,16]。笔者发现 HCV-RNA 定量阳性者的血清ALT、TBIL 水平高于阴性者,ALB 水平低于阴性者, 高病毒载量者的血清ALB 水平显著低于低病毒载量者, 血清ALT、TBIL 水平高于低病毒载量者,经 Pearson 线性相关分析证实随着HCV-RNA 定量越高,患者的肝功能损害越重,血清ALB、ALT、TBIL 表达异常越明显。因此,临床医师可通过测定HCV -RNA 定量对患者肝功能受损程度进行预测,制定针对性的治疗方案。本研究提示不同基因分型患者的肝功能指标无明显差异,提示基因分型可能无法预测患者的肝功能受损程度,未来将对此进一步论证。

综上,FQ-PCR 法在HCV-RNA 定量与基因分型检测中应用效果较好,研究显示HCV-RNA 定量与血清ALB、ALT、TBIL 水平具有较大相关性,临床需对此引起重视。