人工牛黄及天然牛黄有效成分的含量测定分析

张 林，庞春洁

（马应龙药业集团股份有限公司，湖北 武汉 430064）

牛黄是我国的一种传统名贵中药材，为牛的胆结石，药用价值较高，其功效主要为解毒、息风、凉肝、开窍、豁痰、清热等[1]。牛黄在我国具有较大的需求量，大约有超过600种中成药是以牛黄为原料制作而成的。然而在牛体内，天然牛黄的自然发生率却比较低，无法有效满足中成药生产以及临床的实际需求。人工牛黄则是将新鲜的牛胆汁作为原料，配以胆酸、牛磺酸、胆红素、微量元素等加工制作而成的一种牛黄替代品[2]。有研究显示，人工牛黄其成份与天然牛黄相近，在某些应用领域可取代天然牛黄入药，具有较好的临床效果。牛黄的主要有效成分之一就是胆红素，胆红素含量的水平直接影响牛黄质量，也是牛黄的重要评价依据[3]。本研究选择液相色谱法测定人工及天然牛黄中胆红素成分的含量，以检测两种牛黄有效成份差异，希望能为新药开发提供技术资料以及试验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

选用安捷伦1260型高效液相色谱仪，北京赛多利斯仪器有限公司的1/10000电子分析天平；昆山超声仪器有限公司的KQ-500DE型超声波清洗器。

1.2 试药

牛黄选购山东省药材公司的天然牛黄以及湖南迪博制药有限公司的人工牛黄；选用中国药品生物制品鉴定所的胆红素对照品；甲醇、三氯甲烷、水分别选择、色谱纯、分析纯、二次纯化水。

2 方 法

2.1 制备溶液

取适量的胆红素对照品，放置在棕色量瓶内，选择二甲亚砜将其溶解，制作成每毫升含0.58 mg胆红素的对照品溶液，该溶液即为储备液。准确量取10.0 mg牛黄样品，置在5 ml棕色量瓶内，选择二甲亚砜进行稀释、定容到刻度，进行10分钟超声处理，然后进行5分钟离心处理，选取上清液过0.22 μm滤膜即可得到供试品溶液。

2.2 色谱条件

选择Agilent C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；选择甲醇-三氯甲烷-1%醋酸（65:32:3）作为流动相，检测波长设置为455 nm，流速设置为每分钟1.0 ml。

2.3 色谱分析

①制备标准曲线：选取2.0 ml对照品储备液，放置在10 ml棕色量瓶内，通过二甲亚砜将其稀释到刻度。分别选取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 ml该溶液，放置于5 ml棕色量瓶内，选择二甲亚砜稀释、定容到刻度。3次进样，对色谱图进行记录，对胆红素平均浓度以及峰面积作线性回归，获回归方程Y=19158X-4859.5，r=0.9998，结果显示当胆红素浓度处于2.29～27.78 μg/ml范围时，线性关系比较理想。②精密度试验：选择9.27 μg/ml浓度20 μl的胆红素对照品溶液，重复6次进样，对峰面积进行测定；结果显示色谱峰面积平均值为215659，RSD为2.57%。显示进样精密度比较理想。③稳定性试验：选取放置在避光、常温条件下的20 μl人工牛黄供试品溶液，在0、1、2、3、4、5、8、10小时进样，对胆红素峰面积进行测量，结果显示峰面积平均值为252278，RSD=2.32%。分析结果显示在避光、常温条件下放置10小时的稳定性比较理想。④重复性试验：准确量取6份批号相同的人工牛黄供试品，进样测定，结果显示胆红素含量平均值为4.73μg/mg，RSD=2.25%，重复性比较理想。⑤回收率试验：准确量取9份人工牛黄，并将其分为3组，每组各3分。分别在3组样品中加入3种高、中、低不同的含量的胆红素对照品溶液，并将其制作成供试品溶液。准确选取20μl供试品溶液进样，每一样品重复测量3次胆红素含量，对回收率进行计算。

2.4 测定样品

选取人工牛黄和天然牛黄，按上述方法将其制作成供试品溶液。准确量取20 μl供试品溶液进样，重复测量3次胆红素含量。

3 结 果

3.1 回收率计算结果

高、中、低三种不同的含量的胆红素加样回收率分别为98.42%、98.62%、98.48%，具体测定结果如表1所示。

表1 回收率计算结果

3.2 样品测定结果

经3次测定，天然牛黄胆红素含量为（44.21±0.27）μg/mg，人工牛黄为（4.92±0.24）μg/mg。

4 讨 论

本试验中对甲醇-三氯甲烷-醋酸、甲醇-三氯甲烷-磷酸作为流动相的选择，进行对比分析，由于磷酸容易析出结晶，而1%醋酸和0.5%磷酸作为流动相效果类似，故本研究选择甲醇-三氯甲烷-1%醋酸（65:32:3）作为流动相。由于胆红素的稳定性较差，选择索氏提取或回流法提取的效果并不理想，所以本研究选择超声进行提取。对于提取溶剂选择上，通过对比试验发现，相对于三氯甲烷等提取剂，二甲亚砜的提取率更高，因此本试验的提取溶剂选择二甲亚砜。在超声时间选择上，分别试验10分钟、15分钟、20分钟，发现超声10分钟提取率最高。同时由于胆红素在光照、加温时易出现不稳定性[4]，建议在HPLC测定中选择棕色量瓶。

分析本研究结果可发现，和天然牛黄相比较，人工牛黄胆红素含量仅为（4.92±0.24）μg/mg，而天然牛黄的胆红素含量达（44.21±0.27）μg/mg，两者差异明显。提示，在选择人工牛黄入药时，其用量可以适当增加。

综上所述，两种牛黄其有效成份含量存在明显差异，HPLC法可对人工牛黄以及天然牛黄的有效成分含量进行精确测定，该方法操作简单方便，准确性高。