金黄色葡萄球菌肠毒素B对人鼻黏膜上皮细胞分泌黏蛋白MUC5AC的促进作用及机制探讨

肖楚丽，谭 潇

（邵阳学院，湖南 邵阳 422000）

慢性鼻窦炎使得鼻黏膜黏液增加，纤毛的清除能力得以降低，从而导致黏液淤积，细菌滋生，进而削弱黏液纤毛清除力，使其系统受到严重损伤，引发恶性循环[1]。黏蛋白存在于鼻腔及鼻窦黏液中，由鼻黏膜上皮杯状细胞或杯状细胞分泌而来，MUC5AC是气道分泌物中主要的黏蛋白，其主要由杯状细胞分泌，能湿化气道，提高上皮细胞功能，其为抵御外界刺激的屏障，但人体如受病原体感染，或吸烟，黏蛋白的分泌量会增多。下面对金黄色葡萄球菌肠毒素B对人鼻黏膜上皮细胞分泌黏蛋白MUC5AC的促进作用及机制进行探究，具体研究内容如下：

1 资料与方法

1.1 试剂

金黄色葡萄球菌肠毒素B购自Toxin Technolog，纯度高于95%。胎牛血清及DMEM/Ham F12培养基从Hyclone购入。胰蛋白酶从Sigma-Adrich购入，MUC5AC ELISA检测试剂盒由武汉华美生物工程有限公司购入，SB203580由Calbiochem购入，鼠抗人磷酸化p38抗体及total=p38抗体从Cell signaiing购入。

1.2 细胞培养方法

本研究选取的鼻黏膜上皮细胞均为下鼻甲黏膜组织，标本来自我院行鼻中隔手术的90例患者，研究前获得患者的同意，并得到医院伦理委员会批准。患者均无鼻炎及哮喘疾病。手术获取患者的下鼻甲标本，将其置于磷酸盐缓冲液中，其中含有100 IU/mL的青霉素及100 mg/L的链霉素，将其置于无菌条件下，反复冲洗，随后置入5倍体积的胰蛋白酶中，将其放置在4℃环境下消化16～18 h。采用习惯吹打2 min，将脱落的上皮细胞收集起来，置入浓度2.5%的胎牛血清中，结束消化。进行离心处理，调整到1000 rpm，离心5 min，收集完全培养基（DMEM/Ham F12培养基中含有10%的胎牛血清、100 IU/mL的青霉素及100 mg/L的链霉素），将细胞漂洗2次，接种在培养板上，并将鼻黏膜上皮细胞中的纤维细胞及红细胞去除，将细胞置入37℃环境中，在5%浓度二氧化碳条件下进行培养，待其融合80%以后，将1 μg/L、10 μg/L及100 μg/L等浓度的金黄色葡萄球菌肠毒素B处理不同时间，用作下一步研究。

1.3 上清中MUC5AC分泌水平检测

采用ELISA法检测培育上清中的MUC5AC分泌水平，当鼻黏膜上皮细胞达到80%～90%时，弃培养基，并将1 μg/L、10 μg/L及100 μg/L等浓度的金黄色葡萄球菌肠毒素B放置24 h，完成后，采用连续冻融方式，将细胞裂解，获取裂解产物后，进行离心处理，调整到1000 rpm离心5 min，取血清进行MUC5AC检测，按照试剂盒步骤要求，将存在MUC5AC抗体的微孔板中加入100 μL待测液，将其置于37℃环境中孵育2 h，经过洗涤后，按照试剂盒步骤要求，进行一抗及二抗孵育。待其显色后，测定450 nm处的吸光度值，计算出MUC5AC分泌水平。研究p38参与MUC5AC分泌时，将细胞与不同浓度p38抑制剂SB203580预处理半小时（1、10及20 μmol/L），然后使用金黄色葡萄球菌肠毒素B作用24 h，采用ELISA法检测MUC5AC分泌水平，步骤同上。

1.4 鼻黏膜上皮细胞中p38磷酸化检测方式

收集浓度为100μg/L的金黄色葡萄球菌肠毒素B，分别处理0 min、15 min、30 min及60 min的细胞，采用蛋白酶及磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液将细胞裂解，获取的总蛋白采用Bradford法测量其浓度，在波长为595 nm的位置测量，随后取20 μg蛋白制作聚丙烯酰胺凝胶，将蛋白凝胶转移到PVDF膜上，使用5%脱脂牛奶，放置在封闭的室温环境中2 h，进行一抗及二抗孵育，并采用Image J软件分析条带灰度值，计算出磷酸化p38与及总p38灰度值的比值。

1.5 统计学方法

所有数据均纳入到SPSS 22.0的Excel表中，进行对比和检验计算，计量资料行t值检验，当P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 金黄色葡萄球菌肠毒素B对人鼻黏膜上皮细胞分泌黏蛋白MUC5AC水平的影响

与经金黄色葡萄球菌肠毒素处理的人鼻黏膜上皮细胞分泌黏蛋白MUC5AC水平比较，经金黄色葡萄球菌肠毒素处理的人鼻黏膜上皮细胞分泌黏蛋白MUC5AC水平更高，且浓度越高，鼻黏膜上皮细胞分泌黏蛋白MUC5AC水平越高，组间对比差异显著（P＜0.05），见表1。

表1 金黄色葡萄球菌肠毒素B对人鼻黏膜上皮细胞分泌黏蛋白MUC5AC水平的影响

2.2 金黄色葡萄球菌肠毒素B对人鼻黏膜上皮细胞p38磷酸化的影响

100 μg/l的金黄色葡萄球菌肠毒素B刺激鼻黏膜上皮细胞30 min后，即可测出p38磷酸化，且时间越久，浓度越高，60 min后到达峰值，细胞内总p38水平无显著变化，磷酸化p38及总p38比值，处理0 min、15 min、30 min及60 min后分别为（0.09±0.03）、（0.10±0.01）、（0.28±0.06）及（0.81±0.05），30 min及60 min与未经金黄色葡萄球菌肠毒素B处理的人鼻黏膜上皮细胞比较差异显著，且时间越长，比值越高（P＜0.05）。

2.3 SB203580对人鼻黏膜上皮细胞分泌MUC5AC水平的影响

人鼻黏膜上皮细胞采用1、10及20 μmol/L p38抑制剂SB203580预处理半小时后，分泌MUC5AC水平分别为（261.23±17.34）、（181.23±12.23）及（91.12±20.78）μg/L，显著低于而未经抑制剂SB203580预处理的细胞分泌MUC5AC水平（310.34±30.11）μg/L，且浓度越高，分泌量越少（P＜0.05）。

3 讨 论

临床研究证实，慢性鼻-鼻窦炎筛窦黏膜中MUC5AC的分泌水平较高，MUC5AC是气道分泌物中主要的黏蛋白，其能湿化气道，提高上皮细胞功能，是抵御外界刺激的屏障，但如果人体病原体感染，会使得黏蛋白的分泌量异常增多，使得黏液的防御能力及纤毛的清除能力得以下降，引发细菌感染，而常见的细菌为金黄色葡萄球菌肠毒素B，其为疾病的主要治病菌，参与到疾病发生的全过程[2]。

感染金黄色葡萄球菌肠毒素B后，鼻黏膜上皮细胞会分泌过多的MUC5AC，从而加重病情，使得气流受阻，黏液堆积在气道中，使得起到的防御功能下降，从而加重感染，引发恶性循环[3]。本次研究结果显示，经不同浓度经金黄色葡萄球菌肠毒素B处理后，MUC5AC分泌水平得以提升，且浓度越高，MUC5AC分泌水平越高，说明金黄色葡萄球菌肠毒素B影响MUC5AC分泌，受细菌感染，黏液分泌过多使得疾病加重。同时研究可知，100 μg/l的金黄色葡萄球菌肠毒素B刺激鼻黏膜上皮细胞30 min后，即可测出p38磷酸化，且时间越久，浓度越高，60 min后到达峰值，时间越长，比值越高，说明金黄色葡萄球菌肠毒素B能激活p38。同时，研究可知，随着p38抑制剂SB203580浓度的提升，MUC5AC分泌水平得以降低，说明MUC5AC分泌与p38磷酸化有着直接关联。

综上所述，金黄色葡萄球菌肠毒素B通过p38促使人鼻黏膜上皮细胞分泌黏蛋白MUC5AC。