基于网络药理学探讨甘麦大枣汤抗抑郁的作用机制

2021-01-16胡文悦韩振蕴常泽林景峰马华萍王振亦

世界中医药 2021年21期

胡文悦韩振蕴常泽林景峰马华萍王振亦

摘要目的：研究基于网络药理学探讨甘麦大枣汤抗抑郁的作用机制。方法：应用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、中药分子机制生物信息学分析エ具库（BATMAN-TCM）及文献搜索获取甘草、小麦、大枣的活性成分及作用靶点，从Genecards数据库获得抑郴症靶点，获得药物疾病交集靶点，通过String在线平台数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并利用Cytoscape软件进行可视化及拓扑学分析筛选核心基因，应用DAVD数据库完成基因本体（CO）功能与京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路的富集分析。结果：共筛出中药活性成分94个，有效靶点49个，药物疾病交集靶点48个。PPI网络发现ALB、CASP3、VEGFA、MYC、CCNDI、ESRI、CTNNBI、AR等可能是关键靶点。GO功能富集分析得到181个生物过程，主要涉及雌激素反应、胆碱能突触传递等。KEGG通路富集分析发现46个通路，主要集中在癌症相关通路、甲状腺激素信号通路、PI3KAKT信号通路、Wmt信号通路等。结论：本研究为甘麦大枣汤的药效物质基础的进一步研究提供了理论基础，同时为其在抗抑郴方面的应用提供了参考依据。

关键词甘麦大枣汤;抑郁;药食同源;网络药理学;作用机制;信号通路;靶点;富集分析

中图分类号：R285

文献标识码：A

doi：10.3969/[J].is.1673-7202.2021.21.008

随着社会进步，人们压力普遍增大，精神心理状态从童年成长到晚年生活均被各种原因不同程度地影响着，以情绪低落、兴趣减退、思维迟缓等为主要表现的抑郁障碍发病率逐年递增，抑郁症患病率高、复发率高、致残率高，导致了严重的社会经济负担，有效安全的治疗方案还在继续研究中。有研究发现，在重症抑郁发生前很多人存在着阈下抑郁状态，阈下抑郁与抑郁症有着相似的程度和相对较轻的病理变化，国内外阈下抑郁发病率约14%左右리，及时干预阈下抑郁能够减少患者向重症抑郁转变，但传统抗抑郁药物存在着不良反应多的问题，中医药食同源方剂很可能是未病状态更易被接受的治疗药物。

抑郁屬中医“郁证”“脏躁”范畴，《金匮要略》有“妇人脏燥，喜悲伤欲哭泣，象如神灵所作，数欠伸，甘麦大枣汤主之”的描述，甘麦大枣汤是中医临床治疗脏躁的经典方，可养心安神、柔肝缓急，在中医各类情志病中都发挥着重要的作用。有学者认为该方可作为防治情志病的基础方4，常与其他中药形成复方组合出现在情志病临床治疗中。有研究发现甘麦大枣汤可以改善抑郁评分，虽然针对抑郁症人群单用疗效并不优于抗抑郁药，但不良反应很少，而且与抗抑郁药合用后明显优于单用抗抑郁药，是抗抑郁潜力药物。“多成分-多层次-多靶点-多通路”是中药治疗疾病的特色，但也是现代科学解释疗效作用的难点。由生物信息学、系统生物学等多学科交又而成的网络药理学拥有解释中药复方作用机制的优势718，目前甘麦大枣汤抗抑郁机制研究均为某一条或某几条通路，系统研究较少，故本研究选用网络药理学方法探讨甘麦大枣汤抗抑郁机制，为其今后在防治抑郁方面的应用提供方向与思路资料与方法

1.1药物活性成分、作用靶点获取与筛选检索中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chi-nese Medicine Systems Pharmacology Database andA-nalysis Platform，Tcmsp）（https：//tcmspw.comtcms.plhp）及中药分子机制生物信息学分析工具库（Bioinformatics Analysis Tool of Molecular Mechanism of Traditional Chinese Medicine，BATMAN-TCM）（ht-p：//bone.naps.org/batman-tcm/）获得甘草、小麦、大枣的化学成分，以口服生物利用度（Oral Bio-availability，OB）≥30%、类药性（DrugLikeness，DL）≥0.18作为筛选条件，由于抑郁症存在血脑屏障功能失调，因此将血脑屏障（Blod-Brain Barrier，BBB）设置为≥-0.3，同时作为限制条件，获取甘麦大枣汤活性较高的化合物。通过ICMSP得到有效成分对应的蛋白作用靶点，并根据已发表的文献报道补充未预测到的活性化合物及靶点。将筛选得到的活性成分靶点蛋白用Uniprot蛋白质数据库（htps：//www.uniprot.org）转化为规范基因名，去重并去掉无对应靶点的活性成分后，使用Cytoscape3.7.2软件构建活性成分-靶点网络图并进行拓扑学分析。

1.2药物-疾病交集靶点获取、网络构建及可视化以“Depression”为关键词检索GeneCards数据库（htes：//ww.genecards.org），获取抑郁相关靶点。将药物靶点与疾病靶点取交集，通过韦恩图形式呈现交集靶点。再将交集靶点上传String在线数据库平台（htps：//string-db.org）构建蛋白质-蛋白质相互作用（ProteinProteinInteraction，PPI）网络模型，将生物种类设定为“HomoSapiens”，最小互相作用國值设定为“MediunConfidence=0.4”，隐藏不相连蛋白，其余设置均为默认设置，得到PPI网络，上传至Cytoscape3.7.2软件进行可视化。

1.3网络拓扑学分析及核心靶点获取应用Cyto-scape3.7.2对PPI网络进行拓扑分析，并以≥1倍介度、紧密度的中位数和≥2倍连接度的中位数为条件筛选核心靶点。

1.4基因本体功能富集分析及京都基因与基因组百科全书通路分析为进一步明确药物与疾病交集靶点具体的功能及其在相关通路中的作用，将交集靶点上传至DAVID数据库6.8版（htps：/david.cifer：.gow/）。以人类为研究对象，应用DAVID数据库将“甘麦大枣汤”的有效作用靶点进行基因本体（Gene Ontology，GO）功能分析以了解靶点主要的作用过程，京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGC）通路分析观察靶点在通路中的分布情况。以P《0.05进行靶基因筛选，得到甘麦大枣汤主要生物过程和药理作用机制中的可能通路，并进一步筛选与抗抑郁相关的信号通路。

2结果

2.1甘麦大枣汤有效成分及作用靶点检索TCM SP数据库、BATMAN-TCM数据库及手工文献并筛选后，共获得候选化合物94个，其中，甘草69个，小麦7个，大枣18个，按OB值从大到小前15名进行排位。获得有效靶点49个，将药物成分-有效靶点数据集导入Cytoscape3.7.2并进行拓扑学分析，得到中药成分-作用靶点网络图，拓扑学分析Degree值前3名分别为小麦与大枣共有成分B-谷甾醇（Degree=34）、甘草中的7-甲氧基-2-甲基异黄酮（De-gree=16）和甘草査尔酮A（Degree_=15），体现了方剂中药物协同发挥作用的特点。见表1，图1。

2.2药物-疾病靶点获取、网络构建及可视化分析

通过Gene Cards数据库得到抑郁相关靶点11478个。将49个药物靶点与11478个抑郁疾病靶点取交集得到48个交集靶点，以韦恩图形式呈现。将得出的48个靶点上传至String在线平台数据库（htps：//string-db.org），构建PI网络模型，将生物种类设定为“HomoSapiens”'，最小互相作用阈值设定为“Mediun Confidence=0.4”，隐藏不相连蛋白，其余设置均为默认设置，得到PPI网络，并使用Cytoscape3.7.2软件可视化，去除游离节点后，图中47个节点为关键蛋白靶点，线条代表蛋白间相互作用，节点越大越亮，度（Degree）越大，线越粗越暗，Combined-score分值越高。见图2～3。

行拓扑分析，网络节点的介度、紧密度和连接度的中位数分别为0.00596293、0.484210539，以≥1倍介度、紧密度的中位数和≥2倍连接度的中位数为条件筛选得到8个核心靶点，分别为ALB、CASP VEGFA、MYC、CCNDI、ESRI、CTNNB1、AR，提示这些核心作用靶点相互作用紧密，在网络中起到关键作用。见表2。

2.4GO功能富集分析及KEGG通路富集分析

2.4.1G0功能富集分析GO功能富集分析得到181个条目（P《0.05），包括生物过程（Biological Process，BP）条目113个，细胞组分（Cell ComponentCC）条目18个，分子功能（Molecular Function，MF）条目50个，每项按P值大小排序取前15条，靶点主要分布在细胞的突触后膜、突触、核浆等，而靶点作用包括药物结合、乙酰胆堿和类固醇受体活性等，而参与的主要生物学过程则包括雌激素反应、胆碱能突触传递及乙酰胆碱受体相关信号通路等。见图4。

2.4.2KEGG通路富集分析通过KEGG通路富集分析，以P《0.05为筛选条件，共筛选出作用通路46条，主要有癌症相关信号通路、甲状腺激素信号通路、刺激神经组织的中的交互、胆碱能突触、细胞凋亡、催乳激素信号通路、PI3K/AKT信号通路Wnt信号通路等。P值最小前20条见图5。

3讨论

甘麦大枣汤临床应用较广，有一定抗抑郁疗效，且其作用有多靶点、多层次作用的特点"。实验研究发现，单用或合用甘麦大枣汤可以从影响单胺类等神经递质、神经内分泌过程、免疫功能及神经可塑性等多个方面改善抑郁"1，具体作用通路有部分得到验证而更多需要探索和实验。本研究采用网络药理学方法探讨甘麦大枣汤抗抑郁可能的作用靶点及通路，筛选的甘麦大枣汤成分对应的49个作用靶点中，48个与抑郁症疾病靶点重合，提示甘麦大枣汤在抗抑郁方面可能有相对契合的靶点基础。

中药成分中，作用靶点最多的有B-谷甾醇、7-甲氧基2-甲基异黄酮和甘草査尔酮A。研究表明，β谷甾醇可调节下丘脑-垂体-肾上腺素轴（Hypothalamic Pituitary Adrenergic Axis，HPA）]，可提高脑内5-HT含量，可能通过影响神经递质及神经内分泌机制来发挥抗抑郁作用。而7-甲氧基-2-甲基异黄酮和甘草査尔酮A均属于黄酮类化合物，该类化合物可通过血脑屏障作用在中枢神经系统，且部分被验证可通过影响单胺类递质、调节HPA轴来发挥抗抑郁作用。

靶点方面，经分析发现甘麦大枣汤抗抑郁主要通过ALB、CASP3、VEGFA、MYC、CCND1、ESRI、CT-NBI、AR发挥作用。研究表明，抑郁动物模型存在星形胶质细胞足周围血管完整性被破坏的表现，BBB通透性会随之发生改变，而修复BBB后，BBB通透性恢复正常则抑郁症状也能得到相应的改善，另有研究表明白蛋白（Albumin，ALB）可以通过营养胶质细胞及其周围血管内皮细胞来起到改善B通透性的作用，甘麦大枣汤可能通过作用于ALB发挥改善BBB通透性来改善抑郁，同时ALB也承担着运输药物分子的任务，使药物成分在体内发挥作用，这可能也是甘麦大枣汤与抗抑郁药合用有更好疗效的可能原因。

CO及KEGG分析得到甘麦大枣汤可能通过在胆碱能突触、多巴胺突触、类固醇激素作用过程，神经活性的配体-受体相互作用以及与细胞增殖、凋亡和神经可塑性相关的P3K/AKT信号通路、Wnt信号通路、ErbB信号通路、CAMP信号通路、神经营养因子信号通路中作用而起到改善抑郁的效果。本研究得到的核心靶点除ALB外其余靶点均在神经可塑性相关调节中发挥一定作用，故下面就神经可塑性相关通路进行细节讨论。

神经营养因子假说是抑郁机制研究热点之该假说认为神经营养因子相关通路对突触可塑性神经元生长再生等方面起着重要作用，而通过对这系列通路的调节可以改善抑郁，包括帮助多巴胺能神经元、5-羟色胺能神经元等神经元的生长成活，对海马、下丘脑等情绪行为相关脑区的营养支持，对神经元再生、调亡以及突触可塑性调节等作用02。相关通路见图6～7。

由图6可知，该系列通路从BDNF与受体酪氨酸激酶受体B（TrKB）特异性结合开始，该过程可使环磷腺苷（CAMP）反应元件结合蛋白CREB磷酸化，从而增加BDNF的转录和合成，增强效应作用。同时，下游多条通路级联反应发生，包括ERK通路、PI3K/AKT通路及PKC通路等，这3个通路均可以通过一系列反应最终激活CREB而更多地产生BDNF。同时，例如，本研究得到的比较集中（靶点较多）且P值较小的PI3K/AKT通路，从包括P3K T-mTOR、P3KAKT-CSK-3β通路效应从而促进细胞再生、调控细胞周期，从PI3K/AKT-Bcl-2-Capase3调控细胞凋亡，从下游VEGF信号途径及MAPK信号途径完成细胞增殖、血管生成及DNA修复功能等，最终改善抑郁症状。既往有实验证明，含甘麦大枣汤的方剂能够通过调控AKT-mTOR及CSK3β发挥类似氯胺酮的抗抑郁作用，而甘草也被证明能够显著降低抑郁大鼠海马区凋亡效应蛋白Caspase-3的表达同时升高抗凋亡蛋白Bcl-xl的表达。有研究表明，中药也可能通过调节VECF通路影响eNOS表达从而改善抑郁大鼠血管内皮细胞同时起到抗抑郁的作用。本研究筛选得到的8个核心靶点中，CASP3、VEGFA、MYC、CC NDI都在上述通路中发挥着重要作用，而AR与ESRI1是雌激素及雄激素相关的蛋白质，它们的作用也可能与该系列通路相关，有研究表明，图6所示的ESR1/2通路是雄激素与雌激素发挥抗抑郁效果的可能途径，甘麦大枣汤的核心靶点中包含了存在性别差异的2种激素靶点，从机制上讲，也许可以更好地保证甘麦大枣汤作用疗效无性别差异。

有研究認为，细胞外NMDA受体被谷氨酸能神经递质过度激活是导致BDNF降低的关键机制之一，而也有研究表明，越鞠甘麦大枣汤可以调控NMDA受体表达增强突触可塑性20，但是否是由甘麦大枣汤原方发挥主要作用需要进一步研究。通路分析中，还有一条Wnt信号通路，甘麦大枣汤核心靶点中CT'NNBL基因编码蛋白产物是β连接蛋白，而Wntβ-连接蛋白通路可以促进神经元再生的经典通路，且这条通路与BDNF通路可能通过CSK3B建立联系2，互相影响彼此调控，起到改善抑郁的作用;有研究表明甘草可影响颇脑损伤大鼠Wnt/B-连接蛋白通路基因表达，具体抑郁相关机制有待进一步验证及研究。

本研究通过网络药理学方法探究甘麦大枣汤抗抑郁机制，展示中药方剂多成分、多靶点、多通路的作用机制，得到的一些通路和核心基因已经得到验证，而VEGFA信号通路、AR与ESRI相关的ERKI/2信号通路、Wmt/β-连接蛋白通路等需要未来继续相关探索，同时甘麦大枣汤原方与其单药、药物主要成分及其加减方在PI3K/AKT-mTOR通路、P3K/AKT-CSK-3β通路、NMDA受体表达通路的效应也需要对照试验明确。甘麦大枣汤作为药食同源经典方，在抗抑郁方面的开发有着广阔的前景，特别是针对机制与重症抑郁类似的抑郁病前状态一國下抑郁的干预，经过未来研究明确其疗效及机制，有望开发更安全、更易被亚健康人群接受的产品，造福更多人。

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