雌激素对小鼠成骨细胞MC3T3-E1氧化应激损伤的保护作用及机制探究

徐昊

(武汉市第四医院，武汉 430000)

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是临床常见的一种女性年龄相关的系统性骨骼退行性疾病，早期无明显症状，随病情发展可表现为骨痛、驼背、局部压痛等症状，是引起老年女性骨折最常见的原因，发病率可达10%～20%[1-2]。既往研究认为，PMOP主要由于雌激素缺乏引起[3]；然而近年来研究显示[4]，氧化应激是PMOP的重要发病机制，活性氧(reactive oxygen species，ROS)增加可以诱导成骨细胞(osteoblast，OB)的氧化应激损伤，影响骨重建，降低骨密度，增加骨折的风险。OB是骨形成的主要功能细胞，来源于骨、骨膜、骨髓及骨外组织，可以合成并分泌多种生物活性物质，参与调节骨的形成和重建[5]。研究显示，随着绝经期妇女年龄的增加，机体的抗氧化系统功能也会降低，导致细胞内的ROS累积，可损伤成骨细胞功能，影响骨的形成[6]。雌激素是生物体重要的内源性激素，可以调节成骨细胞和破骨细胞间的平衡，对于骨的形成和骨量维持具有重要作用[7]。近年来研究显示，雌激素可以通过弱化活性氧作用，增加抗氧化酶的表达，调节破骨细胞和成骨细胞的活性，维持骨吸收和转换的平衡，但其具体的作用和机制尚不清楚[8-9]。因此，本研究探讨了雌激素对小鼠成骨细胞MC3T3-E1氧化应激损伤的保护作用，并进一步阐明了其对MC3T3-E1细胞分化能力的影响及机制，旨在为雌激素在PMOP治疗中的应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞

MC3T3-E1细胞由中国科学院上海生命科学研究院提供。

1.1.2 主要试剂与仪器

β-雌二醇(批号190409)购自上海广锐生物科技有限公司；α-MEM培养基(批号190615)、10%胎牛血清(批号190407)、CCK-8检测试剂盒(批号190712)购自上海经科化学科技有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(批号190916)和ROS荧光探针购自北京绿源伯德生物科技有限公司；JC-1荧光探针购自 Molecular Probes公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)(批号190410)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)(批号 190326)购自南京建成生物科技有限公司；兔抗鼠Smad5、Runx2、Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3、β-actin 单克隆抗体和辣根过氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)标记羊抗兔IgG均购于美国CST公司。

流式细胞仪(FACScan)购自美国FranklinLakes公司；多功能酶标检测仪(iMark680)购自Bio-Rad公司；荧光显微镜(ix71)购自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 MC3T3-E1细胞氧化应激损伤模型的建立

将MC3T3-E1细胞培养于质量分数为10%热灭活胎牛血清的α-MEM培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中贴壁培养，每周换2次培养液。将贴壁培养至对数生长期的细胞分为空白对照组、H2O2组(300 μmol/L)、H2O2+ 雌激素 0.1 μmol/L 组、H2O2+ 雌激素 1 μmol/L组、H2O2+ 雌激素10 μmol/L 组和H2O2+NAC 1 mmol/L组。除空白对照组加入α-MEM培养液外，其他各组细胞均加入含H2O2(终浓度为300 μmol/L)的培养液孵育3 h，诱导氧化应激损伤。处理后，采用无血清培养液洗2遍，除空白对照组和H2O2组加入α-MEM培养液外，其他各组细胞均加入含相应浓度药物的培养液继续孵育，培养24 h过夜，用于检测细胞的生物学特征。

1.2.2 CCK-8实验检测细胞的增殖

取贴壁培养24 h至对数生长期的细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，以3×10-4mL密度接种至96孔板，37℃、5%CO2培养箱中贴壁培养24 h后，分组与相应药物孵育，分别于24、48、72 h的细胞，弃培养液，每孔分别加入10 μL CCK-8溶液，继续培养4 h，采用酶标仪检测570 nm波长的吸光度值。

1.2.3 试剂盒检测细胞的MDA和SOD水平

取各组与相应浓度药物孵育24 h的细胞，吸去培养基，PBS洗3次后采用IP细胞裂解工作液裂解细胞，离心(10 000 rpm，10 min)，取上清，硫代巴比妥酸法检测MDA；黄嘌呤氧化酶法检测SOD水平。

1.2.4 荧光探针法检测细胞的ROS水平

用无血清的α-MEM培养液稀释DCFH-DA(终浓度为10 μmol/L)，装载探针。取各组与相应浓度药物孵育24 h的细胞，吸去培养基，加入DCFH-DA培养基重悬细胞，孵育20 min后，采用无血清细胞培养液洗去未进入细胞内的DCFH-DA，荧光酶标仪检测ROS水平。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞的凋亡

取各组与相应浓度药物孵育24 h的细胞，离心(1000 rpm，5 min)，弃上清，依次加入 5 μL 的AnnexinV-FITC和propidium iodide进行染色，室温避光孵育30 min，经70目的细胞筛过滤后，采用流式细胞仪分析细胞凋亡率。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位

取各组与相应浓度药物孵育24 h的细胞，2.5%胰酶消化，离心(1000 rpm，10 min)，加入1 mmol/L的 JC-1染色工作溶液 1 mL，37℃孵育30 min，JC-1缓冲液洗3次后，倒置荧光显微镜下分析荧光强度，流式细胞仪分析JC-1阳性率。

1.2.7 Western Blot检测细胞分化和凋亡相关蛋白表达

取各组与相应浓度药物孵育24 h的细胞，细胞裂解液提取总蛋白后经BCA法进行蛋白定量，SDSPAGE凝胶电泳，转膜，室温封闭2 h，加入一抗(Smad5、Runx2、Bcl-2、Bax 和 Cleaved Caspase-3，稀释比例均为1∶1000)4℃孵育过夜，以β-actin作为内参，洗膜加 HRP标记的二抗(稀释比例为1∶5000)室温孵育2 h，电化学发光显影，分析对比条带强弱。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0软件对所得数据进行分析，满足正态分布计量资料均以平均值±标准差()表示，采用单因素方差分析比较组间差异性，若组间比较有差异，采用SNK-q比较两组间差异性，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 雌激素对MC3T3-E1细胞增殖的影响

表1结果显示，与空白对照组比较，H2O2组细胞在不同时间点的增殖活性明显下降(P＜0.05)；与H2O2组比较，H2O2+雌激素1 μmol/L组、H2O2+雌激素10 μmol/L组和H2O2+NAC 1 mmol/L组细胞在不同时间点的增殖活性明显升高(P＜0.05)。

2.2 雌激素对MC3T3-E1细胞凋亡水平的影响

流式细胞仪检测结果显示(图1)，与空白对照组比较，H2O2组细胞的凋亡率明显升高[(11.74±2.18)vs(4.85 ± 0.53)，P＜ 0.05]；与 H2O2组比较，H2O2+雌激素 1 μmol/L组、H2O2+雌激素 10 μmol/L组和H2O2+NAC 1 mmol/L组细胞的凋亡率明显下降[(8.86±0.95)、(6.71±0.72)、(6.53± 0.65)vs(11.74 ± 2.18)，P＜ 0.05]。

2.3 雌激素对MC3T3-E1细胞线粒体膜电位的影响

流式细胞仪检测结果显示(图2)，与空白对照组比较，H2O2组细胞的JC-1阳性细胞率明显增加[(9.70±1.53)vs(3.85±0.42)，P＜ 0.05]；与 H2O2组比较，H2O2+雌激素1 μmol/L组、H2O2+雌激素10μmol/L组和H2O2+NAC 1 mmol/L组JC-1阳性细胞率明显下降[(7.82±0.93)、(5.61±0.65)、(5.54±0.62)vs(9.70±1.53)，P＜ 0.05]。

2.4 雌激素对MC3T3-E1细胞氧化应激水平的影响

表2结果显示，与空白对照组比较，H2O2组MDA和ROS水平明显升高(P＜0.05)，SOD活性明显下降(P＜0.05)；与H2O2组比较，H2O2+雌激素1 μmol/L 组、H2O2+ 雌激素 10 μmol/L 组和 H2O2+NAC 1 mmol/L组 MDA和 ROS水平明显下降(P＜0.05)，SOD活性明显升高(P＜0.05)。

2.5 雌激素对 MC3T3-E1细胞 Smad5、Runx2、Bcl-2、Bax和cleaved Caspase-3表达的影响

图3、表3结果显示，与空白对照组比较，H2O2组细胞Smad5、Runx2和Bcl-2蛋白表达明显下降(P＜0.05)，Bax和cleaved Caspase-3蛋白表达明显升高(P＜0.05)；与 H2O2组比较，H2O2+雌激素1 μmol/L组、H2O2+ 雌激素 10 μmol/L 组和 H2O2+NAC 1 mmol/L组细胞 Smad5、Runx2和 Bcl-2蛋白表达明显升高(P＜0.05)，Bax和cleaved Caspase-3蛋白表达明显下降(P＜0.05)。

表1 雌激素对MC3T3-E1细胞增殖的影响(n＝6，)Table 1 Effect of estrogen on proliferation of MC3T3-E1 cells(n＝6，)

表1 雌激素对MC3T3-E1细胞增殖的影响(n＝6，)Table 1 Effect of estrogen on proliferation of MC3T3-E1 cells(n＝6，)

注：与空白对照组相比，∗P＜0.05；与H2O2组相比，#P＜0.05。(下表同)Note.Compared with blank control group，∗P＜0.05.Compared with H2O2group，#P＜0.05.(The same in the following tables)

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图1 雌激素对MC3T3-E1细胞凋亡水平的影响Figure 1 Effect of estrogen on apoptosis of MC3T3-E1 cells

图2 雌激素对MC3T3-E1细胞线粒体膜电位的影响Figure 2 Effect of estrogen on mitochondrial membrane potential of MC3T3-E1 cells

表2 雌激素对MC3T3-E1细胞氧化应激水平的影响(n＝6，)Table 2 Effects of estrogen on oxidative stress in MC3T3-E1 cells(n＝6，)

表2 雌激素对MC3T3-E1细胞氧化应激水平的影响(n＝6，)Table 2 Effects of estrogen on oxidative stress in MC3T3-E1 cells(n＝6，)

images/BZ_102_237_1718_2241_1768.png空白对照组Blank control group 3.45±0.34 27.80±2.13 9.75±0.78 H2O2组H2O2group 6.78±0.68∗ 20.36±2.07∗ 14.48±1.24∗H2O2+ 雌激素 0.1 μmol/L组H2O2+estrogen 0.1 μmol/L group 6.51±0.66∗ 21.07±2.20∗ 13.42±1.25∗H2O2+ 雌激素1 μmol/L组H2O2+estrogen 1 μmol/L group 5.32 ± 0.51∗# 23.65 ± 2.24∗# 12.56 ± 1.21∗#H2O2+ 雌激素10 μmol/L组H2O2+estrogen 10 μmol/L group 4.76 ± 0.43∗# 25.71 ± 2.15∗# 10.61 ± 1.06∗#H2O2+NAC 1 mmol/L组H2O2+NAC 1 mmol/L group 4.51± 0.45∗# 25.89± 2.21∗# 10.74± 1.02∗#F 87.451 26.143 52.695 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表3 MC3T3-E1细胞Smad5、Runx2、Bcl-2、Bax和cleaved Caspase-3表达(n＝6，)Table 3 Expression of Smad5，Runx2，bcl-2，Bax and cleaved caspase-3 in MC3T3-E1 cells(n＝6，)

表3 MC3T3-E1细胞Smad5、Runx2、Bcl-2、Bax和cleaved Caspase-3表达(n＝6，)Table 3 Expression of Smad5，Runx2，bcl-2，Bax and cleaved caspase-3 in MC3T3-E1 cells(n＝6，)

images/BZ_102_237_2489_2241_2539.png空白对照组Blank control group 0.25±0.02 0.30±0.03 0.27±0.03 0.25±0.03 0.24±0.02 H2O2组H2O2group 0.18±0.02∗ 0.21±0.02∗ 0.22±0.02∗ 0.48±0.04∗ 0.45±0.03∗H2O2+ 雌激素0.1 μmol/L组H2O2+estrogen 0.1 μmol/L group 0.18±0.02∗ 0.22±0.02∗ 0.23±0.03∗ 0.47±0.04∗ 0.44±0.04∗H2O2+ 雌激素 1 μmol/L组H2O2+estrogen 1 μmol/L group 0.20± 0.02∗# 0.25 ± 0.02∗# 0.27 ± 0.03# 0.41 ± 0.04∗# 0.39 ± 0.03∗#H2O2+ 雌激素10 μmol/L组H2O2+estrogen 10 μmol/L group 0.22 ± 0.03∗# 0.27 ± 0.03∗# 0.30 ± 0.03∗# 0.34 ± 0.03∗# 0.33 ± 0.03∗#H2O2+NAC 1 mmol/L组H2O2+NAC 1 mmol/L group 0.22± 0.02∗# 0.27± 0.02∗# 0.30± 0.02∗# 0.33± 0.03∗# 0.33± 0.02∗#F 77.961 63.285 17.632 95.240 89.437 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

图 3 MC3T3-E1 细胞 Smad5、Runx2、Bcl-2、Bax和cleaved Caspase-3表达Figure 3 Expression of Smad5， Runx2， bcl-2， Bax，and cleaved caspase-3 in MC3T3-E1 cells

3 讨论

氧化应激是指细胞内氧自由基尤其是ROS的产生与抗氧化能力失衡的一种状态，可以引起多组织细胞的氧化损伤[10]。已有多项研究显示[11-12]，氧化应激是导致PMOP发生的主要原因之一，细胞内过多的ROS可以诱导成骨细胞和骨细胞的凋亡，影响骨形成和吸收过程的平衡。雌激素是机体重要的内分泌激素，具有广泛的生物学作用，可以调节骨的形成和吸收，目前已逐步应用于PMOP患者的替代治疗[13]。既往研究显示[14]，雌激素可以增加细胞内抗氧化酶的表达，清除细胞内过多的ROS，调节破骨细胞骨吸收和成骨细胞骨形成的平衡，但作用机制尚不清楚。因此，本研究建立了体外成骨细胞氧化应激损伤模型，来分析雌激素成骨细胞氧化应激损伤的作用。H2O2是一种常见的活性氧自由基，可以穿透细胞膜，诱导细胞的氧化应激损伤，与PMOP的发生发展密切相关[15]。因此，本研究采用H2O2诱导MC3T3-E1细胞的氧化应激损伤，来分析雌激素的作用。本研究中，H2O2诱导MC3T3-E1细胞的增殖活性明显下降，细胞凋亡率明显升高，经浓度为1 μmol/L及以上的雌激素作用后，MC3T3-E1细胞的增殖活性明显增加，凋亡率明显下降。周雪娟等[16]的研究显示，雌二醇可以上调成骨细胞内抗氧化酶的表达，减轻骨质疏松大鼠的氧化应激损伤，提示雌激素可以促进氧化应激损伤成骨细胞的增殖，抑制其凋亡，其具体的作用机制有待于进一步深入研究。

本研究中，MC3T3-E1细胞经H2O2诱导后，细胞内Smad5和Runx2蛋白表达明显下降，经浓度为1 μmol/L及以上的雌激素作用后，细胞内Smad5和Runx2蛋白表达明显升高。已有研究显示[17-18]，Smad5/Runx2信号轴在成骨细胞的分化中具有重要的调节作用，细胞外信号分子磷酸化Smad5后，可以与Smad4结合形成复合物并进入细胞核，与Runx2相互作用，调节成骨细胞的分化。王慧等[19]的研究显示，雌激素可以通过多种信号通路调节成骨细胞Runx2的表达，提示雌激素可能通过调节Smad5/Runx2信号轴的表达，提高成骨细胞的分化能力。本研究中，MC3T3-E1细胞经H2O2诱导后，细胞内MDA和ROS水平明显升高，SOD活性明显下降，经浓度为1 μmol/L及以上的雌激素作用后，细胞内MDA和ROS水平明显下降，SOD活性明显升高，提示雌激素可以提高细胞内抗氧化酶的表达，降低ROS水平，改善细胞的氧化应激状态。

本研究中，MC3T3-E1细胞经H2O2诱导后，JC-1阳性细胞率明显升高，经浓度为1 μmol/L及以上的雌激素作用后，细胞JC-1阳性细胞率明显下降。JC-1是实验中常用的一种检测线粒体膜电位的荧光探针，在线粒体膜电位降低时，JC-1为单体出现绿色荧光[20]，提示雌激素可以升高氧化应激损伤MC3T3-E1细胞的线粒体膜电位。线粒体是细胞内能量代谢的中心，线粒体膜内外的电位差变化可以影响细胞内的能量代谢，影响细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学过程[21]，提示雌激素可能通过恢复线粒体膜电位，促进H2O2诱导MC3T3-E1细胞的增殖，抑制其凋亡。本研究中，H2O2可以诱导MC3T3-E1细胞Bax和cleaved Caspase-3蛋白的表达上调，Bcl-2蛋白的表达下调，经浓度为1 μmol/L及以上的雌激素作用后，Bax和cleaved Caspase-3蛋白的表达下调，Bcl-2蛋白的表达上调。Bcl-2和Bax为一组调控线粒体凋亡途径的蛋白，cleaved Caspase-3为细胞内凋亡的执行蛋白，可以降解细胞内多种重要蛋白，诱导细胞凋亡[22]，提示雌激素可以恢复线粒体膜电位，上调氧化应激损伤MC3T3-E1细胞Bcl-2/Bax的表达，抑制细胞凋亡。

综上所述，雌激素可以调节Smad5/Runx2信号轴的表达，促进H2O2致氧化应激损伤MC3T3-E1细胞的增殖和分化，降低细胞的氧化应激水平，抑制其凋亡，有望应用于临床治疗。但本研究尚处于初步探索阶段，其雌激素保护H2O2致氧化应激损伤MC3T3-E1细胞的具体机制尚需进一步验证。