TRIM32与相关疾病的研究进展

张 晗，孟宪勇，赵学萍，董晓华

(1.河北北方学院河北省神经药理学重点实验室，河北 张家口 075000；2.河北北方学院附属第一医院，河北 张家口 075000)

蛋白质翻译后修饰(post-translational modification，PTM)过程包括甲基化、磷酸化、乙酰化、泛素化等，PTM对蛋白质的活性及功能发挥具有重要作用。TRIM32是一种泛素连接酶(ubiquitin ligase enzyme,E3)，能与特异性的底物蛋白结合，介导蛋白的泛素化，被泛素标记的蛋白质将被特异性地识别并被蛋白酶体系统迅速降解。近年来研究表明TRIM32与病毒感染、肿瘤、肢带肌萎缩症及神经精神系统疾病等密切相关，现对TRIM32在抗病毒、抗肿瘤、肢带肌萎缩症以及神经精神系统疾病中的作用进行综述。

1 TRIM家族

三结构域蛋白家族(tripartite motif protein,TRIM)的成员之一非洲爪蟾核因子7(Xenopuslaevisnuclear factor 7,XNF7)在1991年第一个被克隆鉴定[1]，随后TRIM家族的其余成员相继被发现和鉴定。现已在人类中发现的TRIM家族基因有65个，在无脊椎动物中发现的不足20个，在单细胞生物中则没有任何发现，在进化越高等的生物中TRIM家族越常见，由此可见TRIM家族是一个快速进化的家族。TRIM家族的大部分成员从N端到C端的结构域依次是锌指结构域(ring finger)、1个或者2个B-box、1个卷曲螺旋(coiled coil)结构域，所以又被称为RBCC家族。除了以上3个典型结构域外，还有一个可变的C-末端，决定了每个TRIM蛋白与其他蛋白相互作用的特异性。TRIM家族经常根据可变C端进行分类，如在人类中发现的TRIM蛋白根据可变C末端结构域被分为了11个亚族(CⅠ～CⅪ)[6]。TRIM家族成员众多，在很多疾病中发挥重要作用，如属于第五亚族的TRIM52，发现其可以泛素化日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)的非结构蛋白NS2A,通过蛋白酶体将其降解，从而抑制JEV在BHK-21和239T细胞中的复制[7]；TRIM5α则可以通过C端的B30.2识别并结合病毒的衣壳蛋白，使病毒的衣壳蛋白裂解，致使其RNA不能发生反转录，破坏病毒的侵染能力，从而在艾滋病传染早期起到抑制作用[8]。TRIM家族在细胞的增殖、分化、转移、凋亡及肿瘤发生、病毒侵染等方面均发挥作用。

隶属于TRIM家族的TRIM32于1995年首次被科学家发现[9]，它是一种具有E3泛素连接酶活性的蛋白，其结构中除了TRIM家族特征性的锌指结构域、B-box结构域和卷曲螺旋结构域之外，还有6个独特的重复性的NHL结构域。2004年的诺贝尔化学奖授予了Irwin Rose等3位科学家，以表彰他们在揭示泛素调节蛋白降解机制中做出的开创性贡献，自此以后，关于泛素化的研究引起越来越多学者的关注。泛素化的具体过程涉及泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme，E1)、泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme，E2)和泛素连接酶(ubiquitin ligase enzyme，E3)，首先E1通过其活性中心的Cys残基与泛素的C端形成硫酯键活化单个游离的泛素，随后E1将活化的泛素传递给E2，最后E3招募特异性底物蛋白和E2，并介导泛素从E2转移到底物蛋白。不同的E3结合特异性的底物蛋白，因此E3在整个泛素介导的蛋白质降解过程中发挥了十分重要的作用，决定了反应的特异性。TRIM32与底物有两种不同的作用方式，一种是通过自身N端的锌指结构域，发挥E3泛素连接酶活性，在蛋白质的泛素-蛋白酶降解过程中发挥重要作用[10]，已知的TRIM32泛素化底物包括actin、ABI2(Abl interactor 2)、c-Myc、dysbindin和PIASy(protein inhibitor of activated STAT4,PIAS家族蛋白之一)等；另一种作用方式是以N端的NHL重复结构结合特异性靶蛋白而激活某些miRNAs，从而调控基因的表达[11]。

2 TRIM32抗病毒作用

病毒是一种极具感染性和传染性的病原微生物，可分为RNA病毒和DNA病毒，当病毒入侵人体时，天然免疫作为人体抵抗病毒的第一道防线会立即被激活，主要通过天然免疫细胞上的模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)识别病原微生物上相对保守的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)，并启动相应的免疫应答机制。病毒相关的核酸成分可被机体Toll样受体(toll-like receptors,TLRs)、维甲酸诱导基因Ⅰ受体(retinoic acid-inducible gene-I-like receptors,RLRs)及胞浆DNA受体(cytoplasmic DNA receptors,CDRs)等特异性识别,通过一系列复杂的细胞信号通路诱导Ⅰ型干扰素(type Ⅰ interferon)及炎症因子表达,从而激发机体抗病毒反应，最终清除病毒。Ⅰ型干扰素分泌到细胞外与细胞表面的干扰素受体(IFN receptor，IFNR)结合，通过经典信号通路JAK-STAT诱导大量抗病毒基因的表达，通过抑制病毒复制和诱导被感染的细胞凋亡从而发挥抗病毒作用[12]。Ⅰ型干扰素基因表达需要依赖多种转录因子协同合作从而激活其转录活性，其中转录因子NF-κB(nulear factor-kappa B)和IRF3(interferon regulatory factor 3)在整个过程中发挥重要作用[13]。有文献报道过量表达的TRIM32可以激活Ⅰ型干扰素和NF-κB下游基因的表达，也可以促进DNA病毒和RNA病毒诱导的Ⅰ型干扰素的产生，是Ⅰ型干扰素表达所必须的蛋白分子，但下调TRIM32的表达则不会有上述反应[14]。

MITA(mediator of IRF3 activation)是多种胞质DNA识别受体通路所共有的下游接头蛋白，静息状态下主要位于内质网(endoplasmic reticulum，ER)。当胞质出现异常DNA，MITA接受来自上游的信号分子刺激活化后，会增强自身二聚体的形成，从ER经由高尔基体转运到核周小泡；并招募激酶TBK1(TANK-binding kinase 1)和IKKβ(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase β)，进一步活化IRF3和NF-κB，启动I型干扰素、III型干扰素及相关炎症因子的产生。干扰素效应和炎症反应不仅作为机体天然免疫反应帮助机体抵御病毒入侵，也促进了适应性免疫的产生，因而MITA在抗胞质内异常DNA的免疫信号通路中具有重要作用。MITA在病毒诱导的Ⅰ型干扰素的表达及DNA和RNA病毒诱导的天然免疫应答中具有重要意义[14]。

文献报道TRIM32作为一种泛素连接酶可特异性泛素化MITA，同时显著增强MITA介导的Ⅰ型干扰素的表达[14]。关于TRIM32泛素化MITA机制，体内外泛素化实验研究显示MITA是TRIM32的直接底物，一系列过表达实验和内源性实验表明TRIM32和MITA相互作用且共同定位在内质网和线粒体，并且TRIM32催化MITA发生Lys-63位连接的多聚泛素化。对MITA蛋白分子上的9个赖氨酸残基进行一系列的基因定点突变，发现TRIM32通过靶向MITA蛋白分子的第20、150、224及236位赖氨酸位点发生泛素化，这4个位点也是MITA发挥功能所必须的。此外，TRIM32还介导了MITA与下游信号分子TBK1的相互作用。由此可见TRIM32在抗病毒感染中发挥重要作用。

3 TRIM32与肿瘤

3.1 TRIM32与奥沙利铂耐药性

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是原发性肝癌的主要类型，是全球死亡率第六的人类恶性肿瘤[15]。研究发现TRIM32在肝癌组织和肝癌细胞系中明显升高，其表达量与肝癌组织学分级、肿瘤大小、乙肝表面抗原(hepatitisB surface antigen,HBsAg)呈正相关，TRIM32表达可用于预测HCC患者的总生存期[16]。奥沙利铂作为一种有效的抗肿瘤药物，被广泛应用于包括肝癌在内的多种肿瘤的治疗，但几乎所有的肝癌患者均出现化疗耐药性[17]。探讨肝癌细胞化疗耐药与TRIM32表达相关性的实验发现TRIM32-siRNA组对奥沙利铂诱导的生长抑制更为敏感，为进一步验证结果，又检验了细胞中凋亡因子caspase-3的表达水平，结果表明TRIM32表达下调可提高HCC患者的化疗敏感性；高表达的TRIM32促进肝癌的发生发展，提高肝癌患者对奥沙利铂的耐药性[17]。此外，TRIM32的表达量与肝细胞癌的组织学分级有关，可用于预测HCC患者的预后。TRIM32是肝癌潜在的预后指标和治疗靶点，也是探讨HCC发病机制的新方向。

3.2 TRIM32与P53

p53是一种肿瘤抑制基因[18]，其编码的P53能够调节细胞的应激反应，包括细胞凋亡、细胞周期阻滞和衰老，在维持基因组稳定和预防肿瘤发生中发挥关键作用,因此P53蛋白被称为基因组守护者。TRIM32是一种新型P53负调节因子，可调节P53介导的应激反应，P53与TRIM32启动子结合，诱导TRIM32过表达；反过来，TRIM32可通过泛素化促进P53降解[19]。TRIM32经常在肿瘤中过度表达，因此很大程度上促进了细胞的致癌转化和肿瘤发生[20]。此外，在LN-2024细胞及其亲代LN-Z308细胞、人正常神经元CRL-10742细胞、结直肠CRL-1831细胞、人肺癌H460细胞和乳腺癌MCF7细胞等细胞中均验证了TRIM32对P53应激反应的调控作用。TRIM32负调控P53蛋白水平，TRIM32基因过表达或基因敲除不影响p53mRNA水平。在构建的TRIM32一系列标记缺失突变体中，发现TRIM32与P53在细胞内存在相互作用，而且TRIM32的NHL结构是结合的必要条件[21]。

3.3 TRIM32与ABI2

ABI2是一种肿瘤抑制因子和细胞迁移抑制因子[22]，酵母双杂交筛选发现TRIM32与ABI2结合，TRIM32可介导ABI2的泛素化。TRIM32的过表达促进ABI2的降解，并促进细胞的生长及转化活性，而缺失环结构域的TRIM32基因突变体表达的蛋白则抑制ABI2的降解[23]。

3.4 TRIM32与XIAP

X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)是新发现的IAP家族的成员之一，是IAP家族中最强的凋亡抑制因子，可直接抑制caspases的表达，并多途径调节细胞凋亡。XIAP基因在大多数肿瘤细胞株中过表达，与肿瘤的进展、复发、预后以及肿瘤化疗耐药密切相关[24]。TRIM32因其独特的NHL结构，可以直接与XIAP结合并相互作用。TRIM32过表达促进XIAP泛素化和蛋白酶体降解，TRIM32基因敲除则相反,因此XIAP也是TRIM32作用于肿瘤的靶点之一。

3.5 TRIM32与RARα

维甲酸是维生素A的代谢产物，是包括维甲酸受体(retinoic acid receptor α,RARα)在内的多种核受体的配体，在细胞的发育、分化、细胞周期和凋亡中发挥重要作用。Sato等[25]的研究表明泛素化是翻译后修饰的一种，在小鼠神经母细胞瘤细胞和胚胎癌细胞中，TRIM32可以与RARα相互作用并增强RARα的转录活性；研究还表明在人早幼粒细胞白血病细胞系HL60中TRIM32可增强RARα介导的转录活性，并稳定RARα；同时，过表达的TRIM32能够抑制细胞增殖并诱导粒细胞分化，甚至是在维甲酸缺乏的条件下。上述结果提示在急性早幼粒细胞白血病中TRIM32是RARα介导的转录的辅助激活因子之一，因此TRIM32可能成为急性早幼粒细胞白血病的潜在治疗靶点。

另有文献报道TRIM32通过促进PIASy降解调节中波紫外线诱导的角质形成细胞凋亡[26]；TRIM32在小鼠皮肤癌和人皮肤鳞状细胞癌中均表达升高[27]。TRIM32可通过P53、ABI2、XIAP等不同机制在肿瘤发生进展中发挥作用，成为肿瘤诊断、治疗的新靶点。

4 TRIM32与LGMD2H和BBS

TRIM32基因缺失或突变与多种疾病有关，如肢带肌萎缩症[26](limb-girdle muscular dystrophy type 2H，LGMD2H)、巴比二氏综合症[28](bardet-biedl syndrome，BBS)。

肢带型肌营养不良症(limb-girdle muscular dystrophy,LGMD)是一种进行性神经肌肉疾病，临床特征包括血清肌酸激酶水平升高、缓慢进行性无力和近侧肢体肌肉萎缩以及在生命的第二或第三个十年发病。LGMD按照遗传学可分为常染色体显性遗传(LGMD1型)和常染色体隐性遗传(LGMD2型)，再根据基因和蛋白缺陷分为不同的亚型，根据受累基因的不同LGMDl分为LGMDlA～LGMDlH 8种类型，LGMD2分为LGMD2A～LGMD2Q 17种类型。LGMD2H是发生在Hutterites人中[29]的常染色体隐性遗传疾病，2002年Frosk等[30]发现TRIM32的D487N突变是导致LGMD2H疾病快速进展的原因之一，LGMD2H的发生与TRIM32突变后影响底物actin的泛素化及与dysbindin的结合有关。

巴比二氏综合症是一种常染色体隐性遗传性疾病，主要有视网膜营养不良、先天性肥胖、多指趾畸形、生殖腺发育不全、智力发育迟缓、肾畸形等临床表现。有文献报道TRIM32的B-box结构域中的P130S突变导致了巴比二氏综合症11型(BBS11)[31]。

5 TRIM32与神经精神系统疾病

5.1 神经的增殖和分化

2009年德国Schwambom教授第一次在神经系统领域阐述了TRIM32的作用，TRIM32可以使胚胎时期位于室管膜下区(subventricular zone,SVZ)的神经前体细胞发生分化，发挥细胞命运决定子的作用。细胞的不对称分裂(asymmetric cell division)作为细胞多样性形成的基础，TRIM32可以调节神经前体细胞的不对称分裂，促使神经前体细胞向神经元方向分化[32]。这种非对称性分裂会产生两类不同的子代细胞，分别朝神经细胞方向和胶质细胞方向进行分化[33]，TRIM32更多的分布在朝向神经元方向分化的子代细胞中。胚胎发育过程中伴随着子代细胞朝神经元方向分化并成熟，TRIM32在细胞水平上的位置分布也会发生改变，从神经前体细胞的胞浆内逐渐转移到成熟神经元的胞核内。TRIM32影响神经元分化的作用涉及2种机制。一方面，TRIM32泛素化c-Myc(神经干细胞增殖的基本因子)，从而使c-Myc成为蛋白酶体降解的靶蛋白；另一方面，TRIM32通过与argonaute蛋白的相互作用增强miRNA let-7a的活性[34]。

随着对TRIM32研究的不断深入，发现其不仅能够调控胚胎时期神经前体细胞的分化，还参与了成年哺乳动物大脑中脑室下区神经干细胞向嗅球神经元分化的过程[35]。TRIM32基因缺失后，神经前体细胞分化缓慢，更多处于增殖状态，分化形成的神经元则更多处于未成熟状态。

5.2 自闭症

最早关于TRIM32与自闭症的研究始于2014年，美国、加拿大、瑞典、英国等国学者在基因拷贝数变异分析中发现一个有趣的现象，自闭症患者的TRIM32基因出现了拷贝数丢失的现象[36]，由此推测TRIM32可能参与了自闭症的发病过程。有文献报道[37]TRIM32高表达于正常小鼠成熟的大脑皮层神经元以及胎脑的内侧神经节隆起区(medial ganglionc eminence，MGE)中间神经前体细胞中，而在TRIM32基因敲除的模型小鼠中胚胎发育过程中TRIM32的缺失导致MGE的神经前体细胞增殖分裂减少，而MGE区神经前体细胞主要为发育和迁移至海马、皮层等区域并最终分化成γ-氨基丁酸(γ-aminobutylic acid，GABA)抑制性中间神经元前体细胞；同时发现TRIM32基因缺陷小鼠的皮层和海马等区域的GABA抑制性中间神经元均大量减少。对TRIM32基因缺陷小鼠进行行为学实验测试，发现TRIM32遗传性缺失导致小鼠出现社交障碍、重复刻板样举止等行为学表现障碍。

5.3 帕金森病

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是常见的神经退行性疾病[38]，在我国平均发病年龄为60岁左右，富含亮氨酸的重复激酶2(leucine-rich repeat kinase 2，LRRK 2)基因突变是该病的发病原因[39]。虽然LRRK2的分子机制尚不明确，但miRNA活性抑制可能是LRRK 2的致病靶点之一。有文献报道[40]TRIM32可直接拮抗由病理性LRRK 2突变体诱导的miRNA活性抑制，提示TRIM32可能是帕金森病的新的治疗靶点。

5.4 其他神经精神系统疾病

慢性应激可以引起各种精神障碍，如焦虑、抑郁等，但具体机制尚不明确。有研究报导[41]慢性轻度应激小鼠抑郁模型慢性应激8周后，小鼠海马中TRIM32表达明显减少，抗抑郁药氟西丁可明显逆转上述行为，有效提高TRIM32表达水平。在轻度应激条件下，TRIM32基因敲除小鼠与TRIM32野生小鼠相比，表现出较少的焦虑、抑郁和多动行为，推测TRIM32在多动症调节中起到重要作用，并可改善慢性应激引起的焦虑和抑郁。

综上，TRIM32与病毒感染、肿瘤、肢带肌萎缩症及神经精神系统疾病的发生进展密切相关。随着生物技术的发展及对TRIM32认识的深入，相信在不久的将来，以TRIM32为靶点的治疗方法或药物将取得突破性进展。