HPLC法同时测定七制香附丸中3种成分

王小艳

(安阳市食品药品检验检测中心，安阳 455000)

七制香附丸由醋香附、地黄、茯苓、白芍、黄芩等22味药材组成，文献表明[1]，香附具有疏肝解郁、理气宽中的功效，为君药，α-香附酮是其主要药效物质之一；白芍具有养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳的作用，为臣药，芍药苷是白芍的主要有效成分；黄芩清热燥湿，为佐药，黄芩苷是其主要活性成分。《中国药典》(2015年版一部)[1]仅测定白芍的含量，对其他成分未进行测定。为了更好地控制七制香附丸的质量，本实验采用HPLC法同时测定芍药苷、黄芩苷、α-香附酮的含量，为完善七制香附丸的质量控制方法提供依据。

1 仪器与材料

1.1 实验仪器

Waters e2695高效液相色谱仪，二极管阵列检测器，美国Waters公司；XS205DU型电子天平，瑞士梅特勒-托利多有限公司。

1.2 试剂与样品

芍药苷(批号110736-201842，97.4%)，黄芩苷(批号110715-201821,95.4%),α-香附酮(批号110748-201815，99.7%)，购自中国食品药品检定研究院。乙腈(色谱纯，J.T.BAKER)。超纯水为Molecular纯水机制备。七制香附丸(安阳路德药业有限公司，国药准字Z41021221，规格6 g/袋)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱采用Waters ZORBAX eclipse XDB C18色谱柱(4.6×250 mm，5 μm)；乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)为流动相，梯度洗脱条件见表1；检测器为waters 2998 PDA检测器；检测波长230 nm(芍药苷)、280 nm(黄芩苷)、254 nm(α-香附酮)；流速1.0 ml/min；柱温为30 ℃。在上述色谱条件下，色谱图见图1。

表1 梯度洗脱条件

A: 对照品;B: 样品峰;C: 阴性对照样品图1 高效液相色谱图

2.2 对照品溶液的制备

精密称取芍药苷、黄芩苷和α-香附酮适量，加70%甲醇配置成浓度分别为0.3095 mg/ml、0.0311 mg/ml、0.0629 mg/ml的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取样品适量，研细，取约5 g，精密称定，精密加入70%甲醇20 ml，称定重量，超声提取30 min，放至室温，用70%甲醇补足减失的重量，滤过，即得。

2.4 阴性对照样品的制备

按处方制备缺白芍、黄芩、香附的阴性对照样品，照“2.3”项下方法制备相应阴性对照溶液。

2.5 线性关系的考察

精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液1、2、4、8、10、20 μl，分别按“2.1”项下色谱条件进行分析，以峰面积为纵坐标(Y，A)，进样量(X，μg)为横坐标绘制标准曲线并进行回归计算，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系

2.6 精密度试验

取对照品溶液，连续进样6次。测得芍药苷、黄芩苷、α-香附酮的RSD分别为0.40%、0.20%、0.40%。

2.7 稳定性试验

取同一样品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12 h测定。测得芍药苷、黄芩苷、α-香附酮峰面积的RSD分别为0.60%、0.70%、1.6%。表明样品溶液在 12 h 内稳定性良好。

2.8 重复性试验

同一样品按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”色谱条件测定。结果芍药苷、黄芩苷、α-香附酮含量的RSD分别为0.2%、0.1%、0.5%。

2.9 加样回收率试验

取样品适量，研细，精密称取2.6 g，共6份，分别精密加入芍药苷对照品2.240 mg、黄芩苷对照品0.289 mg、α-香附酮对照品0.444 mg，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”色谱条件下分析。计算加样回收率。结果见表3。

表3 加样回收率测定结果

2.10 样品含量测定

精密称取3批样品，每批5 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”色谱条件下分析，测定含有量，结果见表4。

表4 各成分含有量测定结果

3 讨论

3.1 检测波长的选择

取芍药苷、黄芩苷、α-香附酮对照品适量，加70%甲醇制成适当浓度的溶液，以70%甲醇为空白，在190～800 nm波长范围内进行光谱扫描，结果表明，芍药苷、黄芩苷、α-香附酮分别在230 nm、280 nm、254 nm处有最大吸收，干扰少且稳定。查阅相关文献[2-4]，发现芍药苷、黄芩苷、α-香附酮的最佳吸收波长分别为230 nm、280 nm、254 nm，所以采用PDA检测器进行检测。

3.2 提取方法的选择

本实验以不同比例的甲醇、乙醇为溶剂，以芍药苷含量、黄芩苷含量和α-香附酮含量分别为指标，观察回流(0.5 h、1.0 h、1.5 h)、超声(10 min、20 min、30 min、40 min)、冷浸(1 h、2 h、3 h)不同的提取方法，结果表明70%甲醇为提取溶剂时，芍药苷含量、黄芩苷含量和α-香附酮含量都最高，超声30 min即可提取完全。

3.3 流动相的选择

本研究考察了甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸水、乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸水等流动相，发现以乙腈-0.2%磷酸水为流动相的色谱图基线更平稳，峰型和分离度都比较好，所以确定其为流动相。

4 结论

通过实验建立了同时测定七制香附丸中芍药苷、黄芩苷和α-香附酮含量的方法，并对该方法进行了方法学验证，进行了阴性干扰试验对比，证明该方法简单、可行。因此增加含量测定项目有助于进一步完善七制香附丸的质量标准，提高药品的质量。