LuxS基因对变异链球菌耐酸性的影响研究

西安医学院口腔医学院 陕西 西安 710021

变异链球菌(Streptococcus mutans,S．mutans,以下简称为变链菌)一直被认为是最重要的致龋菌[1],在人们的口腔微环境中占有很关键的生态地位。在其诸多致龋的特性中,耐酸性是一个非常关键的因素。耐酸性主要是指细菌能在酸性环境中生长,并在这种环境下代谢碳水化合物产酸的水平。耐酸性包括了2个层面的概念[2－3],分别被称为基本耐酸(Constitutive acidtolerance)以及耐酸反应(Acid tolerance response,ATR)。此次实验中介绍了变链菌标准株和LuxS缺陷株分别在不同p H值酸性环境下的生长状况,为下一步的研究奠定基础。

1 材料与方法

1．1 实验菌株和培养基 变链菌Ingbritt C国际标准株及本实验室成功构建并保存的LuxS基因缺陷株[3];TSA固体培养基及牛心脑浸液培养基(BHI)。

1．2 仪器设备和试剂 紫外分光光度计,美国BECKMAN公司;TGL－16C高速冷冻离心机,上海飞鸽;电热恒温水浴箱,杭州蓝天化检仪器厂;隔水式恒温培养箱,上海安亭科学仪器厂;R200电子天平,德国;进口96孔微量板。

1．3 实验方法 将变链菌Ingbritt C标准株和LuxS缺陷株常规复苏,提纯鉴定为纯菌后,分别于4℃、3 000 r/min离心l5min并弃去上清液,将收集的细菌沉淀物用无菌生理盐水稀释,振荡器振荡混匀1 min后,用紫外分光光度计于600 nm处调整制备为吸光度(A)约为0．7的菌悬液备用。

配制p H值3．5～7．0、间隔0．5的一系列BHI液体培养基,按照l∶10(V/V)的比例将两种菌液接种于BHI液体培养基,两种菌株均培养48 h,并设置为3份样品。离心弃清后逐一测定吸光度值,以无菌生理盐水为阴性对照。将两菌液接种于配制好的p H值3．0的BHI液体培养基,在酸化培养前后分别取样稀释,菌液浓度在菌落计数器上计数并推算出来,算出的比值即酸化前后菌液浓度之比,又称之为生存率。

1．3．3 统计学分析 应用SPSS 13．0软件包进行数据分析,实验数据以均值±标准差(±s)表示,通过双因素方差分析来比较不同p H组和菌种间的差异,检验水准α＝0．05。

2 结果与分析

如表1所示,p H值为6．0～7．0时,标准株和LuxS缺陷株均生长良好,同一p H值时和3组不同p H值下,两菌株细菌的生长差异均无统计学意义;p H值5．5时,两菌株生长均受到影响,其吸光度都显著下降;p H值5．0时,缺陷株生长受到明显抑制,而标准株仍保持一定的生长态势;p H值4．5时,缺陷株与标准株相比几乎没有表现出生长态势,而标准株生长也受到了明显影响;p H值4．0、3．5时,两种菌株的生长态势都不明显;将两菌株在p H值3．0下培养30 min,缺陷株生存率(0．0064%)与标准株生存率(0．0790%)相比明显降低。

表1 变链菌标准株和LuxS缺陷株在不同p H下吸光度(A)值的比较

当变链菌长期生长在相对低的p H值环境时,可能发生耐酸反应,随之其会具备一定的适应性耐酸能力。从表中实验结果可知,LuxS基因缺陷株一定程度下能适应相对微弱的酸性环境,其生长可以不受很大影响,仍能正常进行。由于变链菌摄取食物中的糖类后,进行无氧酵解并马上产生大量的酸,酸积聚促进了对牙菌斑的酸冲击,最终会导致牙釉质脱矿,从而促进龋齿形成。体内p H遥感监测证明,在3 min内,受到年龄阶段、牙菌斑的成分和食物中碳水化合物浓度的影响,牙菌斑p H值会随着糖类的摄入逐渐从7．0降低到4．0[4]。对变链菌指数期浮游细胞的研究显示,p H值从7．5变为5．5超过2 h就会诱导酸耐受反应,其在p H 3．0下的生存率就会得以提高。因此此次研究将p H值5．5选作预酸化的p H值。p H值5．5时,两种菌株的吸光度都明显降低,其生长能力显著变弱。可能是因为菌内多种酶和细菌细胞壁在外周酸性p H值的影响下受到了损伤,其完整性及通透性产生了变化,进而影响了细菌的生长繁殖[5]。

变链菌生长繁殖和产酸代谢随着外部环境p H值进一步降低,酸性进一步加强时,其生长受到的抑制影响表现就会越强。当p H值降至4．0、3．5时,越来越高的酸性环境已损伤两种菌株的多种酶和细胞壁,其菌体生长都受到显著抑制。

3 结论

变链菌标准株与LuxS缺陷株的耐酸性有一定差异,LuxS缺陷株相对于标准株,抵抗外部的低p H值环境能力有所下降。两种菌株在耐酸反应方面都表现出了一定的适应性,也进一步表明了LuxS基因对于变链菌而言,对其生理功能和毒性调节方面具备比较大的影响作用,为后期继续研究LuxS基因的其他相关功能以及发现龋齿防治的新方法打下良好的基础。