TTC法快速测定南京椴种子生活力的研究

朱思宇， 周思雨， 祝 燕， 李吉春， 谈建中

(1.苏州大学建筑学院风景园林系， 江苏 苏州 215123； 2.苏州园林发展股份有限公司， 江苏 苏州 215008)

南京椴(TiliamiquelianaMaxim.)为椴树科(Tiliaceae)椴树属(Tilia)高大落叶乔木，为我国特有种。南京椴集观赏价值、经济价值及药用价值于一身，综合利用价值很高。南京椴资源的开发利用正日益受到重视[1]，但其苗木繁殖比较困难，资源不充足，目前种子繁殖仍是其最常用的繁殖方式之一。研究表明，南京椴种子饱满程度各不相同，又具有深度休眠特性[2]，持续可达2～3年甚至更久，因此无法通过发芽率试验判断种子质量的优劣。种子生活力是指种子发芽的潜在能力和种胚具有的生命活力，是判定种子质量好坏的重要指标之一[3]，其中TTC法测定种子生活力已成为国际通用种子检测方法[4]，适用于绝大多数种子，具有快速、有效、准确的特点[5]，但在南京椴种子生活力测定中的应用研究目前尚少见报导。另一方面，南京椴种子由于种皮致密坚硬、透水性差，即使在温水中浸泡一周仍然坚硬，很难切取种胚进行生活力测定，这是TTC法快速测定南京椴种子生活力时需要解决的实际问题。为此，本研究采取不同的种皮处理方式对南京椴种子TTC染色活力进行了测定，并选择TTC浓度、染色温度与染色时间三因素进行了正交试验，以优化TTC法快速测定南京椴种子生活力的技术条件，为南京椴种子质量鉴定与种苗生产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的南京椴果实在泥炭土∶蛭石∶黄沙=1∶1∶1的基质中层积催芽4个月，取出果实清洗干净后，用锤子轻击果实、剥去果皮，取出完整种子用于试验。

1.2 试验方法

1.2.1种皮处理

选取外观完好的南京椴种子，分4种方法对种皮进行处理： 1) 使用解剖刀小心剥去种皮(去皮处理)； 2) 在种子侧面小心切出一个缺口，露出胚乳(切刻处理)； 3) 使用锤子轻击种皮至产生一道裂口(裂口处理)； 4) 种子种皮不做任何处理、直接浸渍于蒸馏水(对照组)。每个试验区均设置3个重复，每次取种子15粒。

1.2.2种子浸渍处理

将上述4种不同种皮处理的南京椴种子浸渍于蒸馏水，置室温下使其充分吸水。其中，对照组种子浸种过夜后，种皮仍很坚硬，无法用解剖刀切开，表明种胚尚未充分吸水；持续浸种10 d后可用解剖刀进行纵切，表明种胚及胚乳已充分吸水。其余各处理区种子浸种过夜后均充分吸胀。

1.3 TTC染色

将浸泡吸水完全的南京椴种子在铺有吸水纸的硬板上，用解剖刀沿纵向将种胚中央切开，取出有种胚的一半放于培养皿中，倒入浓度为0.15%的TTC染液(现用现配)，浸没种子，于30 ℃恒温培养箱中黑暗条件下染色40 min。

各个试验区的种子染色结束后，取出种子立即用清水清洗，观察染色情况。其中，种胚全部被染为红色与淡红色，或者胚轴染成淡红色、且胚顶端或两端被染成红色的即判定为有生活力的种子。

1.4 正交试验设计

在上述试验结果的基础上，选取TTC浓度、染色温度和染色时间作为影响种子生活力测定准确性的主要因素，设计L9(33)正交试验(表1)，进一步优化南京椴种子TTC染色检测方法。

表1 南京椴种子生活力测定条件正交试验的因素和水平

1.5 调查项目及数据处理

种子饱满度(%)=(获得种子个数/供试果实个数)×100%；

种子生活力(%)=(有生活力的种子数/供试种子总数)×100%；

采用SPSS 23软件对数据进行统计分析，判断各种皮处理组之间的差异。

2 结果与分析

2.1 南京椴成熟果实的种子饱满度调查

供试南京椴果实经层积催芽后，取出清洗干净、记录所取果实数，并用锤子轻击果实，剥去果皮，取出的种子按单粒(果实发育1个完整饱满种子)与复粒(果实发育2个完整饱满种子)、饱满与空瘪(果实未发育成完整饱满种子)等不同情况进行调查，分析种子饱满度情况，结果如表2所示，三批果实的种子饱满度平均为64.7%。可见，供试的南京椴果实在层积催芽4个月后其种子饱满度并不高。

表2 供试果实的种子饱满度

2.2 种皮不同处理对南京椴种子生活力测定结果的影响

由表3可见，未处理对照组的种子不但需要长时间浸种，且种子生活力也较低，仅31.1%，很难准确判定种子生活力的实际情况；去皮处理组由于种皮坚硬，去皮处理难度很大，耗时耗力，种子生活力仅为20.0%，显然也不能准确判定种子生活力的情况；与此相比，切刻处理组与裂口处理组测得的种子生活力较高，分别为80.0%与64.4%，两者的处理效果无显著差异，但与另外两组的处理结果之间的差异显著。

表3 南京椴种皮不同预处理种子生活力测定结果

2.3 南京椴种子生活力TTC测定方法的优化

南京椴种子经种皮不同处理后，在染色试验过程中普遍出现染色较浅的现象；推测可能与TTC染色效果的影响因素有关。为此，在分析前人研究结果的基础上，选择TTC染色液浓度、染色温度及染色时间3个主要因素进行了正交试验，以优化TTC染色法的技术参数，结果如图1和表4所示。

表4 南京椴种子TTC速测法的正交试验结果

在不同因素与水平组合处理下，南京椴种子生活力介于76.7%～96.7%之间，存在较大差异，其中以0.2%TTC、40 ℃、染色2 h条件下种子生活力最高，染色效果也最好(图1)，明显优于其他处理组合；而组合0.1%TTC、30 ℃、染色1 h条件下种子生活力最低，染色较浅，效果较差(表4)。

注：A为染色条件为0.15%TTC、30 ℃、染色1 h，染色较浅； B为优化处理Ⅴ，染色条件为0.15%TTC、30 ℃、染色2 h；C为优化处理Ⅶ，染色条件为0.2%TTC、40 ℃、染色2 h。

方差分析结果(表5)表明，3个因素中，染色温度和染色时间对生活力测定具有显著影响(p<0.05)，TTC浓度对生活力测定影响不显著(p>0.05)。三者对南京椴生活力的影响程度从大到小依次为：染色时间、染色温度、TTC浓度。

表5 南京椴种子生活力测定正交试验的方差分析结果

3 讨 论

种子生活力对于快速检验植物种子的质量具有重要指导意义[6]，但因南京椴种皮坚硬、透水性差，很难快速、准确判断其种子生活力。为此，本研究首先调查了4种不同的种皮处理方式对种子生活力测定的影响，发现种皮不同预处理方法对种子染色速度和生活力测定值具有显著影响，其中未处理对照组的种子短期内很难充分吸胀，导致种子生活力测定的结果不够准确，去皮处理浸种12～15 h后，种子活力明显偏低，也不能作为判断的依据，且去皮处理费时费力；而裂口处理或切刻处理进行浸泡不仅处理相对简单、浸泡时间大大缩短，结果也相对准确。尤其是切刻处理方法能确保种胚完整不受损伤，结果准确，可以认为这是快速、准确测定南京椴种子生活力的有效处理方法之一。

染色浓度、染色温度以及染色时间是TTC法快速测定种子生活力的主要影响因素[7]。本研究采用正交试验方法，筛选南京椴种子生活力TTC测定的适宜条件。结果表明，随着染色浓度、染色时间与染色温度的优化，TTC法可以快速、准确地测定南京椴种子生活力。其中采用0.2%TTC、染色温度40 ℃、染色时间2 h组合处理时，其种胚染色效果较好，表现为染色程度较深，种子生活力高达96.7%，可以认为这是南京椴种子生活力TTC速测法的优化条件。

采用TTC速测法获得的南京椴种子生活力并不低，明显高于实际生产中的发芽率，这是因为南京椴果实的种子饱满度各不相同，有的果实内没有发育完全的种胚(空瘪种子)，有的因层积催芽持续时间较长而霉烂变质。另一方面，南京椴种子自身存在的机械障碍和胚乳中含有抑制萌发的物质[8-9]，使得种子成熟后早期的发芽率较低。因此，本研究的南京椴种子生活力TTC速测法虽然具有快速、简便、准确等优点，可用于评估南京椴种子的潜在发芽能力，但同时还需要考虑层积催芽方法对发芽率的影响，将两者结合起来可更好地应用于播种育苗生产。