富集环境对猪决策行为的影响

2020-12-11张振玲编译

猪业科学 2020年6期

张振玲（编译）

（徐州生物工程职业技术学院动物工程学院，江苏徐州 221006）

爱荷华博弈任务（Iowa Gambling Task, IGT）是研究决策，尤其是风险决策行为的一种惯用方法。IGT通过模拟真实情境以测试受试者在规避和承担风险时的决策行为，最初是为了测试前额叶皮质损伤患者在头脑不甚清醒的情况下，做选择的能力而开发设计的，随后稍做修改应用于临床研究，精神类疾病患者在IGT测试中均表现欠佳。为研究和评估猪的决策行为，开发了猪的博弈任务（Pig Gambling Task, PGT）。PGT 测试中供试猪只有两种选择（有利或不利），供试猪只宁愿选择回报较小但却更频繁的奖励（有利选择）而不选择回报高但频次却较低的奖励（即不利选择）。PGT测试中的惩罚主要是使奖励物无法得到（逆向惩罚）。最优策略就是做出受到较少惩罚和获得较小回报的有利选择，而不是得到更多惩罚和更大回报。

动物的生存环境影响其学习和完成博弈任务的能力。

1 研究目的

研究不同圈舍条件（富集和贫瘠环境）对猪只决策行为的影响。饲养在贫瘠环境中的仔猪经历长期压力，假设贫瘠环境中饲养的仔猪，比饲养在富集环境中的同窝仔猪学习最优策略的速度更慢，以及做出不利选择的行为更频繁。两组供试仔猪在14周后均再次进行测试，以评估PGT中决策行为能力的长期保留情况。技能获取和保留阶段结束后，立即采集唾液和毛发样本，以测定其中的皮质醇了解猪只急性和慢性应激情况。为了评估富集环境对猪生长性能的影响，所有供试猪只均在3周龄和26周龄时称重。

2 材料和方法

2.1 动物伦理方面

本研究得到荷兰乌得勒支大学（Utrecht University）伦理委员会审查和批准并在欧盟第86/609/EEC号指令下进行。尽量减少供试动物的使用量并避免使供试动物产生任何痛苦。

2.2 试验项目和仪器

2.2.1 供试动物

从10窝仔猪（杜洛克×大白或杜洛克×丹系长白）中选出20头公仔猪。仔猪出生在乌得勒支大学德托勒克农场，每窝仔猪数10～15头。母猪胎次情况没有记录。所有仔猪3～7日龄断尾，不剪牙，不去势。1周龄后开始所有仔猪都可接触盛有“Romelko“乳猪料的料槽，在断奶前和后各1周使用“Romelko prevent 3”教槽料。

3周龄时选择供试猪。每窝选择最接近平均窝体重的1对公仔猪，并将其中1头随机分配到贫瘠环境，另1头随机分配到富集环境中。4周龄时，供试仔猪断奶的同时剃净仔猪的肋两侧，以便后期取毛发进行皮质醇含量的测量，然后再送到试验中心（靠近仔猪出生的圈舍旁）。在试验中心，供试仔猪在各自的试验环境组里（贫瘠环境和富集环境）组成数个重复群（每群10头）其试验时序表（见图1）。供试仔猪均按体重级别并按照饲料供应商的建议进行饲喂。

2.2.2 猪舍

两个大小相等相邻猪舍（5 m×4 m）其中1个设置为贫瘠环境，另1个提供富集环境，两个猪舍都有上盖覆盖的仔猪窝巢（1.3 m ×3.6 m)。环境富集猪舍及仔猪窝巢区的混凝土地板上覆盖1层厚稻草以刺激猪只拱刨行为和探索行为，此外还有置于地板上的球、足球和木棒及串联在链子上的塑料咀嚼棒和球等环境富集材料。贫瘠环境也包含1个链条，1个球和2个咀嚼棒，以满足最低的动物福利要求。贫瘠环境猪舍及仔猪窝区混凝土地板裸露。两猪舍猪只都可自由饮水，在非训练和试验日，每天早晨提供猪只全天饲料。训练和试验期间每天早上只提供25%的饲料，其余75%晚上才能吃到。

图1 是断奶、取唾液和毛发样本时供试猪大约周龄或日龄以及体重情况，以及在PGT试验中猪适应、获得和保留技能各测试时间。从左至右依次为：第20天（原文中是第26天有误，从图上看应是第20天）选择和称重仔重；第24天唾液取样；第33天断奶：赶往试验圈栏；第38天仔猪适应试验人员和奖励；第40天适应试验区，剃毛（断奶1周后）；第42天供试猪群体适应性通过，并能打开中央食槽得到奖励；第49天单个供试猪进入试验区（打开食槽和目标盒）；第52天球置于碗上方10 cm处；第53天球置于碗上方；第55天训练，将奖励（巧克力）置于中央食槽；第63天，1 d强化试验20次；第69天强化试验，将2枚巧克力置于有利选择的目标盒里，4枚置于不利选择的目标盒里；第70天开始获得技能阶段，共进行120次试验，然后采集唾液和毛发样品；第161天进行4次强化试验；第162天进入技能保持阶段，共进行12次试验，然后采集唾液和毛发样品；第177天，称重。

2.2.3 试验装置

试验在位于猪舍附近的PGT试验装置中进行（图2）。每个斯塔特盒（start box）大小为1.2 m2，与测试场地（3.6 m×2.4 m）经由1个前厅（1.2 m2）相连。测试台上有两个目标盒，每个目标盒具有由1个大的硬塑料球（直径为24 cm）覆盖的食物碗。球可以从碗里升起，但不能被移走。由试验者远程操控。前厅和测试场地之间的门总是大开，以增加斯塔特盒的大小。目标盒是试验的关键点所在。用荷兰一家公司产的M&M's®巧克力作为给猪只奖励，控制系统（可控制奖励能否获得以及获得多少）位于测试场地的另一面（背面），距两个目标盒的距离相等（图2. B，C，D）。奖励物置于两个漏斗中，连接到装置后部的”Y”形输送管上，该管道连接测试场中的一个食槽（图2A）。试验人员控制从漏斗向食物碗中释放奖励物（图2C）。该食物管道由透明且有孔洞的盖子（Perspex®）覆盖着，盖子打开与否由试验人员（通过升高或降低）控制（图2D）。巧克力落下的声音，透明的碗盖等一些线索可使供试只猪通过声音、嗅觉或味觉等感受到食物碗中有巧克力奖励。

2.3 试验程序

2.3.1 习惯试验装置设备及训练（供试群体）

供试猪只到研究中心后要不受干扰地待4 d。然后，在接下来的2 d里，供试猪只适应并习惯试验设备以及奖励物—巧克力。两个试验处理组的供试猪只分别单独离开各自圈舍进入通往试验区的走廊。到达后1周，每个试验处理组分别允许每天3次（连续2 d）在等待室和PGT装置中进行探索。封闭进入目标盒的通道（即关闭目标盒前面的门）。在接下来的2 d里，两个试验处理组（各10头）每天各进行2次训练，训练供试仔猪探索PGT装置。供试仔猪在斯塔特箱中停留约30 s，才能允许进入测试室。然后，在接下来的2 d时间里，两个试验处理组的仔猪每天各进行2次训练（供试仔猪由最初每组各10头减至各5头然后再减至各2头）。最后，在接下来的2 d时间里，两个试验处理每组只有1头供试猪只进入试验区。试验开始的时候，奖励物巧克力散置于角落和中央食槽。随着试验的进行，巧克力只置于中央食槽中。当猪把所有的巧克力奖品都吃光，即可进入下一步训练。

2.3.2 试验装置训练（单头供试猪）

一个大且硬的红色塑料球悬挂在装有巧克力奖励的目标盒的食物碗上方10 cm处。在1.5 d的时间里，进行3次训练，使供试仔猪推动或举起塑料球以得到巧克力。接下来的试验，目标盒中的球被降下以完全覆盖食物碗。这些供试仔猪在中央食槽发现并得到了巧克力奖励。在3个连续的试验中，在1.5 d的时间里，试验仔猪只有在中央食槽中才能获得奖励。经过大约5 d的训练，所有的供试验仔猪都学会了推动或举起塑料球，以便在中央食槽中得到奖励。

有些试验仔猪总是接近同一个目标盒（某侧偏好）。为了打破供试猪只的这一习惯，在供试猪只进入测试区之前，首先打开偏好侧对面的目标盒且关闭偏好侧的目标盒（强化试验）。接下来的5 d里，每头供试仔猪接受2组（每组10次）强化试验。任何能使塑料球移动的举动都可以得到中央食槽里的巧克力奖励。然后，连续6 d两个试验处理的仔猪每天接受2组（每组10次）试验，即每头供试仔猪每天接受20次试验。左侧或右侧的目标盒按伪随机（pseudorandom）的次序打开，对每个试验处理每头供试仔猪各打开5次。试验猪只移开有利选择目标盒可能得到了2个巧克力奖励，移开不利选择目标盒则有可能得到4个巧克力的奖励。每头猪的优势侧是左还是右是猪随机决定的。

2.3.3 获得和保持阶段

接下来两个目标盒均打开，供试猪只可以选择推动或举起其中任一个目标盒中的塑料球。对供试仔猪进行为期6 d的试验，每天1个试验处理组。对每个当天进行试验的处理组每天进行2次试验（每次连续测试10次）。每只供试仔猪连续测试10次，每次试验持续时间通常在35～70 s之间。每头试验仔猪完成第10次试验，使其离开PGT试验设备。对同一试验处理（富集或贫瘠环境）的供试仔猪一个接一个的测试。然后，对另一试验处理组的供试仔猪采用同样的测试程序。每个试验处理设置一个重复。在斯塔特箱呆30 s后，控制门打开，供试猪只进入测试区。仔猪对目标盒中的任何正确反应（推动或举起塑料球）后都会有奖励被传递到中央的食物碗中，碗上盖有透明有孔塑料盖，可以使猪只看并且闻到巧克力的味道。巧克力奖励的数量以及能否得到预先已设定好。选择有利目标盒的奖励虽然每次只有2个巧克力，但是得到的可能性是80%。选择不利目标盒的奖励每次有4个巧克力，但能得到的可能性只有30%。从长远来看，在每组20项试验中，供试猪只做出有利选择实际最多可得到32个巧克力奖励，而不利的选择实际最多只可获得24个。当供试仔猪完成选择后，给其25 s时间享用巧克力奖励。如果供试仔猪在60 s内没有做出选择，两个目标盒都将关闭，供试猪将在测试区再停留60 s（延迟时间60 s再进行试验）。然后，再让供试猪只进入斯塔特箱，下一次试验开始。循环进行试验，重复10次。当获得技能阶段（6个试验组的2轮连续10次的试验，即总共120次试验）结束时，训练暂停。

经过14周的保留时间段再次进行测试。所有供试验猪先进行了4次强化试验，2次打开左边目标盒，2次打开右边目标盒，每打开1次目标盒供试猪只得到1个巧克力奖励。本试验证实所有供试猪只都记得已学会的技能。与获得技能阶段不同的是，在保留阶段供试猪只体格已经长得较大，很难再在斯塔特箱中呆下。因此连续6 d，每天只进行了1轮测试，连续进行20次（每天6次，各20次，即总共120次）。

2.4 唾液和毛发中的皮质醇浓度

2.4.1 唾液和毛发取样与称重

断奶前2 d第1次取唾液标本。遗憾的是唾液样本量不足以可靠地测定皮质醇浓度。断奶后1周，将供试仔猪两肋侧的毛发剃掉以利于取样和测定毛发皮质醇浓度。遗憾的是最后毛发量亦不足以测定皮质醇的浓度。

获得技能和保留技能阶段最后1次（第120次）试验结束后立即采集唾液和毛发样本。每头供试仔猪用两根棉签（德国汉堡海因茨棉签150×4 mm WA 2PL）吸取唾液，进行进一步分析。14:00～18:00采集唾液标本。每头供试猪只都嚼棉签直到棉签完全润湿为止。供试仔猪靠近试验人员并不由自主地嚼棉签（即意味着取样过程中猪没有受到任何干扰或限制）。

然后，每头供试猪只由1名试验人员抓住，然后由另1名试验人员剃取猪胁侧的毛发，每头收集0.5～1 g。毛发样品在室温下存放在铝箔中。

在保留阶段结束后，在最后1次试验结束之后，按照上述方法再次收集唾液样本。毛发采样时，供试猪只已经和试验人员非常熟了，无需额外的人员辅助，试验人员顺利地剃取了供试猪只毛发样品。

第3周和第26周测量所有供试猪只体重。

2.4.2 唾液皮质醇

将棉签置于特殊的带有内心的离心管中并在10 ℃快速离心10 min（3 500 g）。除去装有棉签拭子的包装后，收集到的唾液储存在同一管中（-20 ℃）待测皮质醇浓度（采用放射免疫法）。所有样品均于同1天检测。单位nmol L-1。

2.4.3 毛发皮质醇

将50～250 mg猪毛发样品用5 ml异丙醇在50 ml试管中轻轻混合清洗（滚轴转速20）3 min，清洗2次，尽量减少粪便和尿液中的皮质醇对毛发的污染。37 ℃干燥4 d后用高精密分析天平称取约50 mg毛发样品置于2 ml离心管中。毛发样品在30 Hz的频率下研磨15 min然后离心（17 000 g，40 ℃）5 min。若样品还不呈粉末状，则重复进行研磨和离心。

将25～45 mg的细粉末置于一离心管（Eppendorf）中。每个离心管中加入1 ml甲醇，在避免光照的室温下保存24 h，同时管子在摇床上缓慢来回摇动。然后4 ℃下17 000 g离心5 min。随后取0.6 ml上清液置于一新管中4 ℃保存。提取物在干燥器中干燥2.5～3 h，中温，然后保存在-20 ℃条件下留待进一步分析。将干燥后的提取物溶于100 μ1磷酸盐缓冲液（测定稀释剂）中，用高灵敏度的唾液皮质醇ELISA试剂盒在300次/min的摇瓶中摇动24 h。样品在-20 ℃条件下再次储存。再根据制造商说明进一步使用ELISA试剂盒进行分析。所有的分析1式2份。光密度数值经校正最后计算出实际使用的毛发量。皮质醇浓度单位为ng.mg-1。

2.5 统计分析

所有分析均采用统计软件SAS 9.4版进行，具体过程略。

3 结果

3.1 有利选择

供试猪只技能获得阶段6个连续试验中做出有利选择数量均有所增加（图3A）且两个试验处理组（贫瘠和富集环境下）的结果相似。贫瘠环境条件下饲养的供试猪只比富集环境条件下的猪只做出更多显著的有利选择。

图3A技能获得和保留阶段每组20组，试验中贫瘠和富集环境中饲养供试猪只做出有利选择的数目。黑色为贫瘠环境，无色为富集环境。

图3B技能获得和保留期间有利选择高于不利选择的试验次数图。黑色为贫瘠环境，无色为富集环境。

图3C技能获得和保留阶段的延迟做出有利和不利选择的试验次数。黑色为不利选择，无色为有利选择。

供试猪只保留阶段做出有利选择的数量略有增加趋势。环境条件不影响保留阶段供试猪只做出有利选择的数量。

供试猪只做出有利选择的数量在获得阶段结束（获得阶段的第6组试验）到保留阶段的开始（保留阶段的第1组试验）之间显著下降，但这一下降不受饲养环境的影响。

3.2 有利选择超过不利选择的试验数量

供试猪只做出有利选择数量略有超过不利选择的趋势且不受环境条件影响（图3B）。

3.3 供试猪只做出有利和不利选择的迟滞反应时间

贫瘠环境条件下饲养的供试猪只做出不利选择比做出有利选择时的迟滞时间长（图3C），但没有得到统计意义上的支持。

3.4 唾液和毛发皮质醇

Shapiro Wilk检验表明所有皮质醇浓度值均呈正态分布。贫瘠和富集环境中断奶供试猪只唾液和毛发样本中皮质醇浓度样本分别在获得阶段后（约9周龄）和保留阶段（约23周龄）后采集。给出了两组分别10头猪的均值和标准差。

3.4.1 唾液皮质醇浓度

技能获得和保留阶段后饲养环境以及取样时间点对唾液皮质醇的测试结果均无影响（图4A）。

3.4.2 毛发皮质醇浓度

饲养环境对毛发皮质醇浓度水平影响不同。贫瘠环境条件中饲养的猪只毛发皮质醇浓度水平比富集环境中饲养的高（图4B），这一差异在技能获得阶段后比保留阶段后更为明显。

3.5 体重

供试猪只体重和生长速度基本不受饲养环境的影响（图4C）。

4 讨论

4.1 技能获得和保留阶段

贫瘠环境条件生长的供试猪只在技能获得阶段与富集环境下饲养的猪相比，会做出更多地有利选择。贫瘠环境条件下生长的猪只学习速度更快，但统计数据并不完全支持。技能获得和保留两个阶段供试猪只做出有利选择数目，均超过不利选择的数目，且不受环境条件的影响。贫瘠环境条件下生长的供试猪只，在技能获得阶段可能更善于权衡每种选择的可能性，最大限度地增加其收益，这意味着贫瘠环境条件下生长的供试猪只记忆能力更好。贫瘠环境条件下生长的猪可能比富集环境下生长的猪，可以更快地揣摩到潜在的可能性。这也间接印证了富集环境中饲养的老鼠学习速度较慢。试验结束时，两个供试组的猪只生长性能水平相当。

4.2 迟滞反应时间

供试猪只做出不利选择时的迟滞反应（犹豫）时间，似乎比做出有利选择时的时间要长，但这一点没有得到统计的支持。更长的犹豫时间通常与错误的选择更相关。

4.3 情感状态

此次试验结果确实证实了贫瘠环境条件中生长的猪的行为与喜欢冒险选择的老鼠的行为相似这一事先假设。但是，贫瘠环境条件可能引致猪只的负面情感状态，并没有促使供试猪只做出更多的不利选择。

富集环境条件下生长的猪只，在有试验人员接近时比贫瘠环境条件下的生长的猪只表现出更多的焦虑行为（表现出更频繁、更快地向后退却的行为）。但是却似乎对新的刺激反应不是那么焦虑，这可能是因为猪圈内环境富集物多的原因。贫瘠环境中生长的猪只比富集环境中的猪群体间更加合作。高度焦虑导致大鼠的行为表现下降（做出有利的选择较少），富集环境条件下生长的猪只在获得技能阶段的表现，与贫瘠环境条件下饲养的猪只相比亦不佳，因为其做出的有利的选择较少。

此次研究中，两种环境下的生长的供试猪只在获得技能阶段虽都表现出较强的，有利选择的倾向，但贫瘠环境条件下生长的供试猪只做出的有利选择较富集环境中生长的猪只更多。这表明贫瘠环境中生长的猪只较富集环境中的生长的猪只更不喜欢冒风险。

4.4 训练可作为环境富集的一种新方式

贫瘠环境中生长的供试猪只，并非没有任何环境富集。与富集环境中生长的供试猪只一样，在适应和习惯测试设备和程序的过程中，以及在PGT设备的训练和测试中，每天都会经历一段时间的照料（环境富集的一种方式）。训练为供试猪只提供了学习机会，而学习亦被认为是环境富集的一种方式。与其他形式的环境富集方式相似，训练也可以减轻动物的应激和压力，并能增加物种的特异性行为、增强动物的生物功能（例如大脑发育、体能和健康），提高其灵活性，增加行为多样性以及提高探索能力。环境富集也能减少动物的一些不正常的行为（如动物的刻板行为）因此，训练作为一种环境富集方式亦可增加猪只的环境富集度，并能影响贫瘠或富集环境中饲养的猪只的行为。

4.5 巧克力中黄酮类风味物质的可能作用

巧克力可激励供试验猪只学习，但巧克力中的类黄酮成分（特别是黄烷醇）也有提高供试猪只的认知效应。1个巧克力重0.9 g，含有70%的可可，50个含有可可31.9 g。单次给大鼠可可100 mg（每100 g大鼠体重）可显著减轻大鼠的恐惧感，长期服用（两周）可提高其大脑中与情绪相关的神经递质血清素（5-羟色胺）的浓度水平及其周转效率。短期摄入可可有抗焦虑作用，而长期摄入则影响脑中单胺类神经递质的代谢。在正常衰老、痴呆和中风的动物模型中，长期服用黄烷醇显示出其对衰老或患病动物的行为和神经认知下降有保护作用，包括减少与疾病和衰老相关的认知下降程度。巧克力（比此次研究中高得多的剂量）具有认知增强效应，但不能完全否认少量的可可亦具有增强认知的可能性。再加上潜在的认知富集效应，这些综合效应可能部分掩盖了圈舍条件对供试猪只PGT表现的潜在影响。

4.6 圈舍大小

此次研究中的猪只比常规饲养的猪只活动空间更大。此次研究中的每头供试猪只都有2 m2空间（研究结束猪26周龄时，贫瘠环境中生长的供试猪只体重为104.60±5.86 kg；富集环境中生长的猪只体重为106.90±5.33 kg（图4C））。此次研究中较大的猪舍空间可能会影响到试验结果，因为猪只享有更大的空间也相当于给予环境富集。更大的空间提高了供试猪只探索圈舍内环境的行为，并减少了攻击性行为的发生。

4.7 唾液和毛发皮质醇浓度

贫瘠的环境对猪只的福利有负面影响。皮质醇水平通常用于评估动物的慢性应激压力及动物福利。此次试验中贫瘠环境中生长的供试猪只毛发皮质醇浓度水平（在富集或贫瘠环境后的前5周）高于富集环境中生长的猪，但在之后的14周则无较大差异。毛发皮质醇浓度水平增加反映了供试猪只长期的应激压力。此次研究表明贫瘠环境中生长的猪只在试验环境中的前几周经历了更多的应激压力。唾液和血液（及粪便）中皮质醇的短期内浓度水平发生变化，不能准确反映其应激情况；毛发皮质醇浓度水平并不代表短时间内（数分钟或数小时计）的应激反应，但是可以更好地反映圈舍环境对HPA轴的长期影响情况。

圈舍环境条件不影响供试猪只的唾液皮质醇浓度水平。但富集环境中饲养的猪只唾液皮质醇的浓度水平与贫瘠环境中的猪相比，有上升的趋势。此次试验研究中唾液皮质醇的浓度只在一个时间点上进行了测量，所以这是目前研究设计的一个缺憾，若测试前和/或测试后包括更多测量时间点的话，环境对唾液皮质醇浓度水平的影响就会显示出来。