基于对BMP7的调控探讨MEBO对糖尿病创面愈合的影响

唐丽珠 麻华胆 隆采丹 李政 王琳 曾娜 吴标良

【摘要】 目的 通过湿润烧伤膏（moist exposed burn ointment，MEBO）对骨形态发生蛋白7（bone morphogenetic proteins 7，BMP-7）的調控来探讨其对糖尿病创面愈合的影响。

方法 按照随机数表将75只Wistar雄性大鼠分为空白组（n=15）、对照组（n=15）、模型组（n=15）、重组牛碱性成纤维细胞生长因子（贝复济）组（n=15）以及MEBO组（n=15），对模型组、贝复济组及MEBO组构建糖尿病模型。生理盐水外敷对照组及模型组创面，MEBO组和贝复济组创面分别给予MEBO、贝复济外敷。各组于治疗后的第1、5、11、18、25天观察创面大小变化及愈合情况，并于上述各个时间点各组随机取3只大鼠在麻醉后快速取创面组织并处死大鼠，标本行HE染色观察创面病理变化及免疫荧光法检测BMP-7的表达。

结果 （1）在治疗过程中，对照组、贝复济组、MEBO组的病理形态明显改善。（2）BMP-7免疫荧光的变化：除了空白组，其他四组的阳染细胞均升高后降低，具体为第5天出现阳染细胞数的高峰是对照组、贝复济组和MEBO组，而第18天达到峰值的是模型组。（3）在模型组、对照组及MEBO组中，BMP-7表达有差异（P<0.05）;而在贝复济组与MEBO 组中无差异表达（P>0.05）。

结论 在糖尿病创面组织中，MEBO可能通过调控BMP-7的表达从而促进溃疡创面的愈合。

【关键词】 湿润烧伤膏;BMP-7;糖尿病溃疡创面

中图分类号：R587.2   文献标志码：A   DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.12.001

【Abstract】 Objective To investigate the effect of moist exposed burn ointment （MEBO） on diabetic wound healing by analyzing its regulation on bone morphogenetic proteins 7 （BMP-7）.

Methods According to random number table method， 75 male Wistar rats were divided into blank group （n=15）， control group （n=15）， model group （n=15）， recombinant bovine basic fibroblast grow （Beifuji） group （n=15） and MEBO group （n=15）. Diabetes models were established in the model group， the Beifuji group and the MEBO group， and the wounds of the model group and the control group were supplied with normal saline， and the wounds of the Beifuji group and the MEBO group were supplied with Beifuji and MEBO， respectively. The changes of wound size and healing were observed on the 1st， 5th， 11th， 18th and 25th days after treatment， and 3 rats in each group were randomly selected at the above time points. After anesthesia， the wound tissue was quickly taken and the rats were killed. The pathological changes of wound were observed by HE staining and the expression of BMP-7 was detected by immunofluorescence.

Results （1） During treatment， the pathological morphology of the control group， the Beifuji group and the MEBO group considerably improved. （2） Changes of BMP-7 immunofluorescence： except the blank group， the positive cells of the other four groups increased and then decreased. Specifically， the peak of the number of positive cells on the 5th day of treatment appeared in the control group， the Beifuji group and the MEBO group， while the model group reached the peak on the 18th day of treatment. （3） There were differences in the expressions of BMP-7 among the model group， the control group and the MEBO group （P<0.05）; however， there were no differences in expressions between the Beifuji group and the MEBO group （P>0.05）.

Conclusion In diabetic wound tissues， MEBO may promote the healing of ulcer  wounds by regulating the expression of BMP-7.

【Key words】 MEBO; BMP-7; diabetic ulcer wound

糖尿病创面是糖尿病慢性并发症之一，它与外周神经病变、血管损伤等疾病并列[1]。胰岛素抵抗增加、血糖水平升高和炎症浸润已经被证明是导致伤口愈合延迟的各种因素[2]。在临床上，糖尿病溃疡创面是一种常见糖尿病并发症。因此有效地促进糖尿病溃疡创面愈合迫在眉睫。骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）是一种蛋白质编码基因，编码转录生长因子超家族β;骨形态发生蛋白信号通路调控不同组织间的细胞增殖、分化和凋亡[3]。研究表明，BMP-7可以通过减少各种炎症因子的表达，从而减轻创面修复中炎症及纤维化水平，减少疤痕形成，进而促进创面愈合[4]。因此，在糖尿病创面愈合过程中是否能通过调控BMP-7而促進创面愈合？研究显示[5]，湿润烧伤膏（moist exposed burn ointment，MEBO）可促进糖尿病创面的愈合，提高患者的生活质量。本课题组前期细胞研究已证明通过外用MEBO可促进糖尿病大鼠创面中成纤维细胞的增殖，促进创面愈合[6]。本研究通过构建糖尿病大鼠创面模型，给予不同干预后，观察BMP-7的变化，为揭示MEBO通过对BMP-7的调控参与糖尿病创面愈合提供理论依据。

1 实验材料与方法

1.1 动物

大鼠75只，3月龄，体重范围在230～260 g（长沙天勤生物技术有限公司）。右江民族医学院动物伦理委员会批准（批准号：2018112001）。

1.2 主要试剂

MEBO（汕头市美宝公司）;贝复济（珠海亿胜生物制药有限公司）;链脲佐菌素（Streptozocin，STZ）（北京华越洋生物科技公司）;水合氯醛（成都科龙化工试剂公司）;BMP-7-Antibody（上海文渊阁生物科技公司）;山羊抗兔Ig（中杉金桥生物技术有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 分组及造模

按照随机数表将75只Wistar雄性大鼠分为空白组（n=15）、对照组（n=15）、模型组（n=15）、重组牛碱性成纤维细胞生长因子（贝复济）组（n=15）以及湿润烧伤膏（MEBO）组（n=15），空白组仅给予备皮处理，对照组建立创面模型，行大腿全层皮肤切除，面积约一元硬币大小;模型组、贝复济组和MEBO组予以高脂高糖饲养4周后，禁食12 h后行腹腔注射STZ，1周后出现糖尿病症状，对存活大鼠进行空腹血糖测定，其空腹血糖值大于16.7 mmol/L，则为造模成功。造模成功后建立创面模型，即切除大腿全层皮肤，面积约2.5 cm×2.5 cm大小，完成创面模型[7]。

1.3.2 标本采集及处理

在创面模型建立后的第1、5、11、18、25天随机取各组大鼠3只，麻醉后快速行创面组织提取并处死大鼠。部分创面组织用10%福尔马林固定制作HE染色及切片，其余创面组织置于-80℃冰箱保存。

1.3.3 HE染色观察病理改变

创面组织固定后依次脱水、透明、浸蜡包埋、切片、烤片、HE染色制片，显微镜下观察成纤维细胞、炎症细胞、毛细血管及肉芽组织等。

1.3.4 BMP-7免疫荧光

取得的切片在脱蜡水化后进行抗原修复、封闭液封闭、孵育一抗、孵育二抗、染色、封片，荧光显微镜下查看荧光细胞染色情况，每张切片采集3个视野，用Image J分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行分析，所有数据用（±s）表示，采用重复测量方差分析进行比较，根据是否满足球性假定选择相应方法。检验水准：α=0.05，双侧检验。

2 结  果

2.1 创面肉眼观

治疗第5天，各组呈半干性创面，色素沉着，边缘结痂，揭痂后见少许肉芽组织。治疗第11天，各组创面无渗液渗出，大部分创面结痂，揭痂后见大量肉芽组织，创面修复明显好转。治疗第18天，MEBO组大鼠的溃疡创面基本愈合;模型组大鼠愈合最差。对照组和贝复济组大鼠其创面干燥及结痂较多;模型组可见肉芽组织生长，肉芽组织呈颗粒状。治疗第25天，各组大鼠其创面均接近愈合。见图1。

2.2 创面病理观察

治疗第5天，坏死带、出血灶及炎症细胞可见在各组创面组织中，模型组最为明显。治疗第11天，观察到各组的炎症细胞浸润明显减轻。治疗第18天，完整表皮在对照组中可观察到，贝复济组、MEBO组见少量成纤维细胞。第25天，完整表皮在各组中可观察到。见图2。

2.3 BMP-7免疫荧光染色结果

在治疗过程中，除了空白组，其他四组的阳染细胞均升高后降低。具体为第5天出现阳染细胞数的高峰是对照组、贝复济组和MEBO组，而第18天达到峰值的是模型组。治疗过程中，除了空白组，其他四组的OD值先升高后下降。见图3、表1。

3 讨  论

糖尿病病人常合并不同程度的血管及神经病变，故糖尿病溃疡创面大多数经久不愈。MEBO的主要治疗技术是湿润暴露疗法[8]。在创面组织中，MEBO不仅能够提供湿润环境，而且能够促进毛细血管的生成以及新生肉芽组织的生长，从而促进创面修复，提高创面愈合质量[9～10]。在本研究中，糖尿病慢性创面予MEBO治疗，治疗后创面炎症细胞浸润明显减轻，直观表现出更高的愈合率。进一步说明了MEBO在糖尿病创面愈合中的积极作用。

随着研究的不断深入，BMPs参与调节多种细胞的增殖、生长、迁移[3]。BMP-7是一种有效的抗炎生长因子，属于TGF-β超家族。经研究发现[4]，BMP-7可减少多种炎症因子的表达，从而减轻创面修复中炎症和纤维化水平，减少疤痕形成，促进创面愈合。TGF-β1是导致肾脏纤维化最重要的因子，BMP-7是TGF-β1超家族成员之一，二者通过相似的下游Smad信号通路，彼此反馈调节[11]。因此，BMP-7也是重要的抗纤维化因子。

在本次研究的治疗过程中，BMP-7阳染细胞明显升高，表明BMP-7的大量分泌，可减少各种炎症因子的表达。研究结果显示，治疗过程中，除了空白组，其他四组的BMP-7表达量均表现为先升高后降低的趋势，具体为第5天出现表达量高峰的是对照组、贝复济组及MEBO组，而第18天达到峰值的是模型组。因此我们认为，在创面早期，机体处于应激状态，炎症细胞因子增多，从而强烈诱发BMP-Smad信号的传导，促进BMP-7的表达。但BMP-7的表达可促进成纤维细胞的过度增殖，进而促使了瘢痕的形成[12～14]。从而使对照组、贝复济组及MEBO组的BMP-7自第5天起逐渐降低，而模型组BMP-7自第18天起逐渐降低，表明在无有效药物干预下，其成纤维细胞增殖率低，未能充分形成肉芽组织，使得模型组的BMP-7在治疗晚期仍保持较高水平，这可能是导致第25天模型组BMP-7的表达量最高。有研究发现[15]，當疤痕形成后，BMP-7通过负反馈来调节机体的表达水平，具体为通过抑制纤维细胞的功能及过度增殖，阻断其与纤维细胞生成关系密切的TGF-β1的信号传导通路，促使纤维细胞凋亡，减少胶原蛋白沉积，从而促进创面愈合。这可能是BMP-7达到高峰后下降的另一原因。

综上所述，MEBO与贝复济均可促进糖尿病创面肉芽组织生成、上皮化，能很好地促进糖尿病溃疡创面的愈合，但MEBO促进创面愈合的效果略佳。我们猜测MEBO促进糖尿病慢性创面愈合的重要途径之一可能是BMP-Smad信号通路。BMP-Smad信号通路在调控创面愈合中起重要作用，它能调控BMP-7的表达，使得BMP-7蛋白表达量改变，从而对创面的愈合起到很好的促进作用。进一步阐明MEBO促进糖尿病溃疡创面修复的分子机制，为临床推广应用MEBO防治糖尿病提供可靠的理论依据。但不同的信号通路激活与拮抗贯穿整个创面愈合过程，因此需进一步研究BMP-Smad信号通路其他因子。

参 考 文 献

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（收稿日期：2021-07-12 修回日期：2021-10-19）

（编辑：潘明志）