加味阳和汤对膝骨性关节炎软骨细胞凋亡的影响研究

高伟华 李玉杰 杨鸿冉 李志超 杨振国 齐鲁 董建文△ 王文波△

加味阳和汤是名家名方，是董建文教授从医40余载的经验总结，治疗骨性关节炎取得了满意的临床疗效[1]，而且通过动物实验发现，加味阳和汤可抑制膝骨关节炎兔关节软骨的退变[2]，减轻软骨细胞的退变，延缓胶原蛋白的紊乱[3]，但是对于其起效的分子机制尚不明确。骨形态发生蛋白-2(Bone Morphogenetic Protein-2，BMP2)是诱导骨组织形成的关键因子，对骨与软骨的修复有明显的促进作用；Sry相关组蛋白9(Sox9)在软骨内成骨的过程中起了关键的作用，是调控软骨细胞增殖和分化的核心，Sox9可促进软骨细胞的生成及发育成熟，还可促进软骨ECM的主要组成成分Ⅱ型胶原(Col Ⅱ)的表达[4]。这与加味阳和汤对于骨性关节炎治疗的现代作用机制相似，因此通过实验设计，观察加味阳和汤对于骨性关节炎中BMP2及Sox9表达的影响，以探讨其治疗骨性关节炎分子机制。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

60只6月龄雄性普通级健康新西兰大白兔，体质量(2.70±0.32)kg，由济南跑马岭动物繁殖中心提供，合格证号为SCXK(鲁)2010005。饲养条件：室温控制在15～25 ℃，相对湿度维持在45%～60%，动物饲料均由济南跑马岭动物繁殖中心提供，动物自由摄食和饮水，饲养及实验地点为山东中医药大学附属医院实验动物中心。

1.2 实验药物

加味阳和汤，药物组成包括熟地黄21 g，肉桂9 g，鹿角胶12 g，海风藤15 g，鸡血藤15 g，麻黄3 g，川牛膝12 g，白芥子15 g等，由山东中医药大学第二附属医院中药制剂室统一煎制。

按照Meeh-Rubner公式：新西兰兔所需药物剂量=人所需药物剂量×兔体表面积A，A=K×W2/3×10-4，W为兔体质量，K为常数(家兔为10，人为10.6)，计算出大鼠给药剂量作为大鼠与成人的等效剂量。兔每只2.5 kg每次服用生药量为12 g，浓煎为20 mL。

其他药物：3%戊巴比妥(山东中医药大学附属医院实验动物中心)，青霉素(鲁抗制药，H37020079)。

1.3 试剂与仪器

pH8.8及pH6.8的Tris-Cl，四甲基乙二胺，30%亚甲基双丙烯胺溶液(Acr/Bis)，10%过硫酸铵(APS)，以上均从上海生物工程公司购买。

10 mL 10%分离胶配置：蒸馏水(dH2O) 4.2 mL，pH8.8 Tris碱2.5 mL，3.3 mL聚丙稀酰胺，10%过硫酸铵 50 μL，四甲基乙二胺5 μL。

5 mL 5%浓缩胶配置：dH2O 2.75 mL，pH6.8 Tris碱1.25 mL，聚丙稀酰胺0.83 mL，2%过硫酸铵200 μL，四甲基乙二胺5 μL。

转移缓冲液10×：甘氨酸29 g，十二烷基硫酸钠3.7 g， Tris碱58 g，dH2O，定容至1 000 mL。

洗膜缓冲液1 000 mL：缓冲生理盐水(TBS)1×100 mL，吐温20(Tween20) 1 mL，蒸馏水899 mL。

缓冲生理盐水(TBS)10×1 000 mL：12.114 g Tris 碱+ 87.75 g NaCl 蒸馏水定容。

电泳缓冲液10×pH8.3：甘氨酸144 g，十二烷基硫酸钠10 g，Tris碱 30.2 g，dH2O 800 mL，定容至1 000 mL。

青链霉素双抗配制：青霉素、链霉素浓度均为100 IU/mL。首先配置母液，浓度为2×104lU/mL，采用400万单位的青霉素1瓶，100万单位链霉素4瓶，加入200 mL的双蒸水中，搅拌溶解即可，-30 ℃保存；每次使用时在100 mL的培养基中加入0.5 mL母液，得到浓度便为100 IU/mL。

聚合酶链反应(PCR)相关试剂：SYBR(DBI公司，德国)，6×上样缓冲液、TRIzol、反转录试剂盒、核酸均购自TAKALA公司。焦碳酸二乙酯(DEPC)水(碧云天)，琼脂糖(上海生工)，Gel Red购自Biotium公司(美国)；PCR引物均由上海华大基因公司合成；异丙醇无水、氯仿、乙醇等试剂由山东中医药大学附属医院中心实验室提供。

鼠抗兔单克隆抗体BMP2，COLL Ⅱ (武汉博士德生物技术有限公司)。一抗：兔抗大鼠、小鼠、人多克隆抗体(武汉博士德生物技术有限公司)。Tunel细胞凋亡检测试剂盒(显色法)，Wanleibio免疫组化试剂盒。抗原修复液(0.01 mol/L，pH6.0 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液)，辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG(Ⅱ抗)及高敏过氧化物酶复合物(SABC)，购自武汉博士德生物工程有限公司。

石蜡切片机(Leica公司)，石蜡包埋机(Sakura公司)，LKB超薄切片机、图像数字分析仪(Bio-RAD公司)，微量加样器(美国Eppendorf公司)；离心机(Thermo，美国)。

1.4 方法

1.4.1动物分组及造模 将60只成年新西兰大白兔随机分为三组，正常组、实验组和模型组，每组20只。实验组和对照组均给以手术制作骨性关节炎模型。

造模方法：采用改良赫尔特法(Hulth法)造模[5]，采用3%戊巴比妥耳缘静脉麻醉后，常规剃毛、碘伏消毒，切皮后将新西兰大白兔一侧膝关节前交叉韧带、内侧副韧带于关节线水平切断并将内侧半月板切除，采用前抽屉试验确认前交叉韧带完全断裂，外翻测试内侧副韧带断裂后逐层关闭伤口。

术后常规给予青霉素50万单位肌注3 d，每天碘伏擦拭手术切口处防止感染。术后1周开始驱赶动物，2次/d，30 min/次，4周后造模成功。

模型组和实验组：每天定时给予灌胃，实验组给以加味阳和汤灌胃，模型组给以等量盐水灌胃，每周灌胃6 d，休息1 d，直至动物被处死。

1.4.2取材方法及观察指标 各组于灌胃后第4，6，8周分别于拍片后处死6只动物。解剖膝关节后，取股骨髁的一部分1 cm厚的组织块于4%多聚甲醛溶液中固定，用于组织切片；其余部分及胫骨髁精确取材，将软骨分离后置于冻存管内，液氮储存。用 Trizol液浸泡，液氮冷冻，用于实时PCR检测。

1.4.3免疫组化监测Ⅱ型胶原表达

1.4.3.1石蜡切片后常规脱蜡至水，于切片滴加3% H2O2，于湿盒中孵育，PBS洗2遍，每遍冲洗3 min；采用复合抗原修复液常温修复10 min，PBS洗3遍，每遍冲洗5 min；而后用H2O2处理标本10 min，再用PBS冲洗3遍，每遍5 min；随后加入稀释的一抗(1∶100)，置于保湿盒中，4 ℃下过夜孵育，而后用 PBS冲洗3次后，滴加HRP标记的二抗，并置于保湿盒中37 ℃孵育20 min后，PBS冲洗3次，滴加3,3′-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)，显色。苏木精复染，细自来水流水冲洗，1%盐酸分化液分化，自来水细流水冲洗。脱水、透明，中性树胶封片，光学显微镜观察。

1.4.3.2实时PCR 监测软骨组织中BMP2和Sox9的表达情况 采用RNeasy Lipid Tissue Mini Kit试剂盒提取软骨总RNA，按照说明书中的步骤操作，大体过程如下。匀浆处理：取出液氮中标本，称取50 mg，于液氮中将组织研磨成粉，然后加入1 mL溶液进行研磨、匀浆、静置、振荡、孵育离心后，按照说明书进行置换操作，吸出溶液总RNA稀释液，进行RNA浓度测定，行cDNA的合成、PCR引物序列扩增(见表1)、 解冻模板、引物及SYBR。

1.4.4TUNEL监测软骨组织中软骨细胞凋亡情况

石蜡切片后常规脱蜡至水后进行TUNEL染色：

表1 引物序列

滴加0.1 % Triton X-100(0.1 %柠檬酸钠盐配制)50 μL，室温放置8 min透化；然后PBS漂洗5 min，3遍；滴加3 % H2O250 μL，室温放置10 min进行封闭；然后PBS漂洗5 min，3遍；滴加TUNEL反应液50 μL，保湿、避光、37 ℃孵育60 min，PBS漂洗5 min，3遍；切片取出，擦干周围多余水分，加DAB底物50 μL，待颜色刚刚变深时迅速置于水中终止反应。PBS漂洗，3×5 min；苏木素复染，脱水、透明、封片。光镜下观察，计算坏死率：各组坏死率=(坏死细胞数/总细胞数)×100%。

2 结果

2.1 软骨组织中Ⅱ型胶原表达情况

正常组Ⅱ型胶原表达量高，阳性染色分布于关节软骨的各层，而模型组阳性染色分别不均匀，骨性关节炎时间越长阳性染色越浅，而实验组染色好于模型组，且分布较均匀，同一时间段内实验组染色较好，且分布均匀(见图1)。

2.2 软骨细胞中BMP2及Sox9表达情况

结果显示：BMP2在正常软骨中少量表达，而在骨性关节炎的骨中有大量表达，骨性关节炎时间约久，BMP2的表达量越多，BMP2的表达量与骨性关节炎的严重程度表现出一致性，而同一时间段内实验组的BMP2的表达量和模型组相比降低(见图2a)。而Sox9表达量表现与BMP表达量不同。在正常组中均有大量表达，而在模型组中表达量明显减少，骨性关节炎时间越长表达量越低，在同一时间段内，实验组均较模型组的表达量多，而比正常组表达量少(见图2b)。

2.3 加味阳和汤对骨性关节炎兔软骨组织细胞凋亡的影响

采用TUNEL法检测各组软骨组织中细胞凋亡结果显示：细胞核内含有棕黄色颗粒的细胞为TUNEL阳性细胞，正常组软骨中凋亡的软骨细胞数量较少(图3a)，而在模型组中同一时间段内软骨细胞凋亡数量较正常组明显增加，骨性关节炎时间越久凋亡细胞数量越多，实验组经治疗后，细胞调亡数量减少(图3b-h)。

图1Ⅱ型胶原免疫组化染色图片(×200)

图2BMP2及Sox9表达量

图3TUNEL法软骨组织中细胞凋亡染色结果(细胞核内含有棕黄色颗粒的细胞为TUNEL阳性细胞)(×200)

3 讨论

骨性关节炎(Osteoarthritis，OA)是一种常见的慢性退行性骨关节疾病，60岁以上人群有膝骨性关节炎表现者约61%[6]，随着老龄社会的进展，骨性关节炎对人类健康的影响越来越大。本病是整个关节功能丧失的疾病，病变涉及到软骨的蜕变与重建、半月板、韧带、滑囊及软骨下骨的改变[7]。软骨细胞作为软骨内唯一的细胞，在骨性关节炎发病过程的作用也越来越受到重视[8]。如何减少软骨细胞的坏死，增强软骨细胞的活力，是治疗骨性关节炎的重要方面。在OA的药物治疗方面，现代医学缺乏有效的干预手段，而中医、中药在其预防和治疗骨性关节炎方面起到了很好的作用[9-10]。但是其起效的机制尚不明确。

Sox9是一个软骨生成的重要调节因子，对于软骨的发育到十分重要的作用，能够调整软骨的成熟与分化，维持软骨的正常表型，促进脊髓间充质干细胞向软骨的分化。是维持软骨细胞形态及功能的重要因子[4]。研究表明正常的软骨中Sox9呈现高表达，而在骨性关节炎中Sox9的表达量明显减少[11]，笔者在实验中也观察到这个现象，骨性关节炎越重Sox9的表达量越低。而加味阳和汤能够调节骨性关节炎软骨中Sox9的表达量。Sox9的高表达能够在一定程度上缓解软骨细胞的凋亡。Sox9的表达受到多方面的调控，虽然有的文献观察到BMP2能够上调软骨细胞中Sox9的表达从而促进Ⅱ型胶原表达[12]，这与笔者的观察结果不一致，这可能由于BMP2在骨性关节炎中的不同作用导致。

BMP2被认为是BMP家族内活性最强的因子，在骨生成过程中起到重要的作用，不仅参与了软骨成骨的过程和滑膜关节的形成过程，并且在大鼠关节软骨的形成和维持正常形态方面起到重要的作用[13]，然而BMP2在骨性关节炎的发生及发展方面起到的作用目前仍有争议[14]。研究表明正成人的软骨中BMP2的表达量很少[15]，而且在不同时期骨性关节炎软骨中的表达量也不尽相同，BMP2在骨性关节炎的增生骨赘[15]、滑膜及半月板[13]及血液中表达量明显增高[16]，而且骨性关节炎时间越久BMP2的表达量越高[16]，这与笔者的观察结果一致。而有的研究显示高表达BMP2后并不能引起关节软骨结构的改变[17]；也有部分研究显示BMP-2在正常软骨的浅层表达，对于维持关节功能起到重要的作用[13]，BMP2的高表达在骨性关节炎的发生过程中能够促软骨的修复，促进软骨细胞增殖[18]，能够对骨性关节炎的软骨起到保护作用[14]。因此，笔者推测对于BMP2在维持骨性关节炎正常软骨功能方面有重要的作用，在进展期骨性关节炎的高表达可能与实验取材的部位(例如滑膜、软骨及增生骨赘)不同及骨性关节炎的造模方法有关系，OA发病时不同实验出现的BMP2不一致变化，可能是实验中仅观察到BMP2变化的结果，但其在OA发病中的作用还需要进一步研究来明确。

笔者在实验过程中发现了BMP2与骨性关节炎的严重程度存在一定的关联性，BMP2对于维持关节功能有重要的作用，而对于BMP2在进展期关节炎的表达增高可能与骨性关节炎期间的骨赘及滑膜增生及细胞外基质退变有关系。笔者推测加味阳和汤能够改善骨性关节炎的分子机制：可能通过下调膝关节中BMP2的表达量，从而减缓骨性关节炎期间的骨赘及滑膜增生及细胞外基质蜕变以及上调骨性关节炎软骨中Sox9的表达量，促进Ⅱ型胶原的表达，以减少软骨细胞的凋亡；但BMP2及Sox9在骨性关节炎中的相互关系仍需要进一步研究。