低共熔溶剂提取枳实中黄酮类成分的工艺研究

李杰，吴艳芳，王新胜，赵明明，王艺文

(1.河南科技大学 医学院，河南 洛阳 471023;2.河南科技大学 化工与制药学院，河南 洛阳 471023)

枳实中的标志性黄酮类成分柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷，由于具有抗氧化、降血脂、增强免疫力等生物活性[1]，被广泛应用于医药、化工和保健品领域。目前针对枳实中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的提取多采用水[2]和有机溶剂[3-6]，提取效率低、能耗高且污染环境。因此，有必要开发一种绿色高效的新型溶剂来提取枳实中的柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷。低共熔溶剂(DESs)，也被称为“类离子液体”，具有和离子液体类似的物理化学性质，但又避免了其制备繁琐、价格昂贵、难生物降解等不足。因此，本研究以DESs为溶剂，采用单因素和响应面法对超声辅助提取工艺进行了优化，以期为枳实的深度开发提供参考。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

枳实，洛阳同仁堂药店；柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷标准品，国家标准物质中心；乙腈、磷酸为色谱纯；乙醇、乙二醇、氯化胆碱均为分析纯。

天美LC2000液相色谱仪；BT125D双量程电子分析天平；KQ2200DE超声波清洗仪；CT14RD高速离心机。

1.2 实验方法

1.2.1 DESs的合成 将氯化胆碱和乙二醇按照1∶1的摩尔比混合于烧杯中，70 ℃水浴加热搅拌1 h，得到无色、透明的DESs溶液。临用前将DESs与水(V/V=4∶1)混合，即得DESs提取溶剂。

1.2.2 供试液的制备 称取2.0 g枳实粉末与DESs提取溶剂混合，按照一定的液料比30∶1(mL/g)、超声功率150 W和超声时间15 min进行提取。每组实验平行进行3次，取平均值。提取结束后，移取提取液2.0 mL，在10 000 r/min的条件下离心3 min，取上清液1 mL于100 mL的容量瓶中，50%甲醇溶液(V/V)定容，摇匀后过0.45 μm滤膜，得供试液。高效液相色谱法检测。

1.3 黄酮含量的测定

1.3.1 色谱条件 色谱柱为Kromasil C18柱子(250×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-水-磷酸(20∶80∶0.020,v/v)；流速为1 mL/min；检测波长为283 nm；进样量为20 μL；柱温为室温。

1.3.2 标准曲线绘制 精密称取柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的标准品20 mg，50%甲醇溶液溶解，然后转移至200 mL的容量瓶中，50%甲醇溶液定容，得标准品储备液。将储备液逐级稀释为5，10，15，20，25 μg/mL的混合标准品溶液。摇匀后过0.45 μm滤膜，高效液相色谱法检测。以混合对照品质量浓度为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，线性回归，得到3种黄酮类成分的回归方程，结果见表1。

表1 线性关系考察结果Table 1 Results of linear correlation test

1.3.3 黄酮总提取率的计算 枳实中3种黄酮类成分总提取率按下式计算：

Y/%=(C1+C2+C3)×V×N/(104×M)

式中Y——3种黄酮的总提取率；

C1、C2、C3——分别为标准曲线得出的柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的含量,μg/mL；

V——提取溶剂体积,mL；

N——稀释倍数；

M——枳实质量,g。

2 结果与讨论

2.1 对照品与供试液的HPLC色谱图

由图1可知，提取物中柚皮苷、橙皮苷以及新橙皮苷与对照品具有相同的保留时间，并且3种黄酮类物质分离完全，杂质峰无干扰，可用于提取物中3种黄酮类成分含量的测定。

图1 供试液(a)和混合标准品(b)高效液相色谱图Fig.1 The HPLC of sample(a) and(b) mixed reference substance1.柚皮苷；2.橙皮苷；3.新橙皮苷

2.2 单因素实验

2.2.1 液料比对3种黄酮总提取率的影响 由图2可知，随着液料比的增大黄酮总提取率逐渐升高。这可能是由于液料比的增大，提高了提取溶剂与药物的接触面积，加大了固液间黄酮类成分的溶度差，使黄酮的传质动力增加，因此使得药物中更多的目标组分溶入提取溶剂中[7]；但液料比过大，超声波能量的传导受到阻碍，导致枳实细胞壁的破碎程度减弱，不利于黄酮类成分的溶出，致使黄酮总提取率下降[8]。因此，选择液料比30∶1 mL/g较为适宜。

图2 液料比对总提取率的影响Fig.2 Effect of solvent ratio on the yield of flavonoids

2.2.2 超声功率对3种黄酮总提取率的影响 由图3可知，随着超声功率的增大，黄酮总提取率先升高后降低。植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和木质素构成，超声波可有效的降低纤维素的结晶度和聚合度，水解半纤维素[9]，DESs对木质素有良好的溶解性[10]。因此，在相同的提取时间内，超声功率越大，细胞壁的破碎程度就越大，黄酮总提取率就越高。但超声功率过大，强烈超声波作用会导致已溶出的黄酮类成分发生降解[11]。因此，选择超声功率125 W较为适宜。

图3 超声功率对总提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasound power on the yield of flavonoids

2.2.3 超声时间对3种黄酮总提取率的影响 超声功率为125 W，由图4可知，随着超声时间的延长，黄酮总提取率先升高后降低。这可能是由于随着超声时间的延长，超声波产生的空化效应使枳实细胞壁的破碎程度趋于完全[12]，利于细胞内的黄酮类成分溶出，但长时间超声破坏了已溶出黄酮物质的结构[13]，使得黄酮提取率降低。因此，超声时间选择10 min较为适宜。

图4 超声时间对总提取率的影响Fig.4 Effiect of ultrasound time on the yield of flavonoids

2.3 响应面分析法优化工艺条件

以液料比、超声功率和超声时间为实验因子，3种黄酮总提取率为响应值，运用Design-Expert 8.0.6.1软件中的Box-Behnken模式，设计3因素3水平响应面实验，优化提取工艺。分析因素和水平设计见表2,结果见表3。

表2 Box-Behnken实验因素与水平Table 2 Factors and levels used in Box-Behnken design

根据表3的实验结果，用Design-Expert 8.0.6.1软件拟合，得到总提取率(Y)对各因素的回归方程Y(%)=-11.79+0.28A+0.98B+0.087C-1.3×10-3AB+7.3×10-3AC-0.010BC-1.31×10-3A2-0.011B2-0.033C2，表4为方差分析结果。

表3 Box-Behnken实验结果Table 3 Box-Behnken experimental results

表4 方差分析 Table 4 Analysis of variance for the fitting regression model

由表4可知，该数学模型F=64.13，P<0.000 1，表明具有极显著性；由失拟项F=1.23，P=0.407 2>0.05，差异不显著，可知模型的拟合良好，实验误差小。模型复合相关系数和校正决定系数分别为R2=0.988 0和AdjR2=0.972 6，说明此模型的实验值与预测值接近，可用此模型和方程来推测实验结果[14]。模型响应值与超声功率、液料比、超声时间高度相关，其中超声功率和液料比达到极显著水平(P<0.01)；超声时间达到显著水平(P<0.05)。超声功率与超声时间交互项、液料比次项以及超声时间二次项均达到极显著水平(P<0.001)，说明各因素对响应值的影响较复杂，不是简单的线性关系。F值可判断各因素对黄酮总提取率影响的强弱，其值越大，影响越大。由此可知，各个因素对响应值的影响强弱为A(超声功率)>B(液料比)>C(超声时间)。

图5分别表示超声时间、液料比以及超声功率取零水平时，其余两个因素对黄酮总提取率的影响的响应面图。

图5 两两因素交互作用对3种黄酮总提取率的影响Fig.5 Response surface plots of operating parameters on the extraction rate of flavonoids

由图5可知，响应值随3个因素的增大先升高后降低，说明最佳提取条件在所选的实验范围内。通过 Design Expert 8.0.6.1软件分析，可知提取条件的最佳为超声功率118.52 W，液料比31.62∶1 mL/g，超声时间9.55 min，理论提取率为20.91%。响应面在底面的投影为等高线图，椭圆形表示显著，而圆形表示不显著。由图5可知，超声功率与超声时间交互作用的等高线最为扁平，因此二者交互作用最为显著；其次为液料比与超声时间；超声功率与液料比的交互作用最小，与方差分析结果一致。

2.4 验证实验与对比实验

为了方便操作，将最佳提取条件修正为超声功率125 W，液料比32∶1 mL/g，超声时间为9 min，在此条件下进行3组平行实验，实测黄酮总提取率分别为20.82%,20.63%,20.90%，平均提取率为20.78%，与理论值20.91%的相对误差为0.62%，说明采用Box-Behnken响应面法得到的最优工艺参数稳定、可靠。 将该提取方法与超声法[15]和乙醇回流法[4]进行了对比，结果见表5。

表5 对比实验Table 5 Contrast experiment

由表5可知，超声辅助低共熔溶剂法，具有时间短、提取率高的优点。

3 结论

以氯化胆碱、乙二醇和水组成的DESs为提取溶剂，采用超声辅助法提取枳实中的柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷，并应用Box-behnken响应面法对该提取工艺进行优化,确立了枳实中3种黄酮类成分提取的最佳条件，即超声功率125 W，液料比32∶1 mL/g，超声时间9 min。在该条件下,3种黄酮的总提取率为20.78%，与模型的理论值20.91%相近。