湿生扁蕾不同提取物抗氧化活性与主要成分相关性研究

梁希晨，刘雪枫，王灏，景明

(1.甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省中药质量与标准研究重点实验室，甘肃 兰州 730000；3.甘肃省中藏药化学与质量研究省级重点实验室，甘肃 兰州 730000；4.甘肃省礼县第一人民医院心内科，甘肃 陇南 742200)

1 仪器与材料

E2695高效液相色谱仪(沃特世科技上海有限公司，色谱柱为WondaSil C18-WR色谱柱)；BT125D电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；iMark全波长酶标仪(美国伯乐公司)。

湿生扁蕾药材于2018年7月上旬采自甘肃省临潭县冶力关镇，经甘肃农业大学陈垣教授鉴定为湿生扁蕾[Gentianopsispaludosa(Munro.) Ma]。当药黄素、当药醇苷和木犀草素(成都普菲德生物技术有限公司， 批号分别为190402、190404、190328，纯度均> 98%)；甲醇、磷酸为色谱纯；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。1,1-二苯基-2-三硝基苦肼(DPPH，西格玛奥德里奇上海贸易有限公司，批号：MKBS3069V)；2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS，北京百灵威试剂有限公司，批号：1436401)；抗坏血酸(Vc， 西格玛奥德里奇上海贸易有限公司，批号：MSDS5960)。

2 方法与结果

2.1 提取物制备 称取药材湿生扁蕾500 g，粉碎，分别用5倍量的水、95%乙醇、正丁醇、乙酸乙酯浸泡22 h后回流提取2 h。提取液回收溶剂后减压干燥得到干燥提取物，研细备用。水提物(A)、95%乙醇提取物(B)、正丁醇提取物(C)和乙酸乙酯提取物(D)产率分别为16.92%、15.56%、5.57%、11.66%。

2.2 HPLC同时测定当药黄素、当药醇苷和木犀草素的含量[6]

2.2.1 色谱条件 WondaSil C18-WR色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相为甲醇(A)-0.04%磷酸水(B)，梯度洗脱(0～20 min,40%～63% A；20～50 min,63%A)；体积流量0.8 mL·min-1；柱温30 ℃；检测波长254 nm；进样体积：10 μL。色谱图见图1。

2.2.2 混合对照品溶液制备 分别精密称取当药黄素、当药醇苷、木犀草素对照品1.5、1.8、0.5 mg，置于5 mL容量瓶中，以甲醇溶液超声使完全溶解，制成当药黄素、当药醇苷、木犀草素质量浓度分别为0.30、0.36、0.10 mg·mL-1的混合对照品溶液，于4 ℃保存备用。

2.2.3 供试品溶液制备 精密称取水提物粉末0.049 4 g、95%乙醇提取物粉末0.050 7 g、正丁醇提取物粉末0.051 0 g、乙酸乙酯提取物粉末0.051 0 g，置5 mL容量瓶中，加入甲醇溶液，密塞，超声溶解，以甲醇溶液定容，以0.45 μm微孔滤膜滤过。

2.2.4 线性关系考察 精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液，0.5、1、2、5、10、15、20 μL依次注入高效相色谱仪，依“2.2.1”项色谱条件下测定。以各对照品质量浓度为横坐标(X)，相应峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线，结果见表1。可知，3种成分在各自线性范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系考察结果

2.2.5 精密度考察 精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液10 μL，以“2.2.1”项下色谱条件下测定，重复测定5次，得当药黄素、当药醇苷、木犀草素峰面积的RSD分别为1.29%、1.18%、0.20%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 重复性考察 按“2.2.3”项下供试品溶液制备方法平行制备5份95%乙醇提取物供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，测得当药黄素、当药醇苷、木犀草素面积的RSD分别为1.19%、1.54%、1.31%，表明该方法重复性良好。

2.2.7 稳定性考察 取95%乙醇提取物供试品溶液适量，按“2.2.1”项下色谱条件，于0、3、6、12、18、24 h测定，测得当药黄素、当药醇苷、木犀草素峰面积的RSD分别为2.91%、2.71%、2.32%，表明供试品溶液在室温下24 h内稳定。

2.2.8 加样回收率考察 精密吸取已测定指标成分含量的95%乙醇提取物供试品溶液1 mL，共6份，分别置于10 mL量瓶中，每份精密加入含有一定量的当药黄素、当药醇苷、木犀草素的混合对照品溶液各1 mL，按“2.2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果当药黄素、当药醇苷、木犀草素的平均加样回收率分别为99.37%、99.93%、100.69%，RSD分别为0.97%、1.22%、1.12%，回收率均符合规定，表明该方法回收率良好。

2.2.9 样品含量测定 精密吸取供试品溶液10 μL， 按“2.2.1”项下色谱条件进样测定记录色谱图，测定峰面积，代入标准曲线进行回归。湿生扁蕾不同提取物样品中当药黄素、当药醇苷、木犀草素的含量测定结果见表2。乙酸乙酯提取物中当药黄素含量最高，为68.19 mg·g-1；95%乙醇提取物中当药醇苷含量最高，为21.03 mg·g-1；正丁醇提取物中木犀草素含量最高，为19.38 mg·g-1。

表2 湿生扁蕾各提取物主要成分含量测定结果(mg·g-1)

2.3 清除DPPH·能力测定[7]

2.3.1 供试品溶液的制备 精密称取湿生扁蕾不同提取物供试品和阳性对照Vc各0.01 g，用无水乙醇溶解(水提物用50%乙醇溶解)并定容至10 mL，得到浓度为1 mg·mL-1的溶液。用无水乙醇稀释成浓度为0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.5 mg·mL-1的供试品溶液。

2.3.2 DPPH溶液的制备 精密称取DPPH 0.019 7 g，加12.5 mL无水乙醇溶于15 mL离心管(离心管外壁用黑布包裹)，摇匀得到浓度为1.576 mg·mL-1的DPPH母液。精密吸取1 mL DPPH母液，加39 mL无水乙醇，得浓度为0.039 4 mg·mL-1的DPPH溶液，置于4 ℃冰箱中，避光冷藏。

2.3.3 测定方法及结果 无水乙醇、DPPH溶液各250 μL，记为A0管；供试品溶液、DPPH溶液各250 μL，记为A1管；无水乙醇、供试品溶液各250 μL，记为A2管；以上各管充分振摇混匀，置暗处反应30 min后，取200 μL加到96孔板中，于517 nm处测定吸光度。平行测定3次。按公式1计算各供试品DPPH·清除率和IC50值。

(公式1)

表3结果表明，湿生扁蕾各提取物对DPPH·均有显著的清除作用，但均弱于阳性对照Vc组。IC50越小说明供试品清除能力越强，结果表明湿生扁蕾醇提取物对DPPH·清除能力最强。不同部位提取物清除DPPH·能力的大小顺序依次为：95%乙醇提取物>正丁醇提取物>乙酸乙酯提取物>水提物。

表3 湿生扁蕾各提取物DPPH·清除率结果

2.4 清除ABTS+自由基能力测定[8]

2.4.1 ABTS工作液的制备 精密称取ABTS 0.096 g，加25 mL蒸馏水定容得浓度为7.4 mmoL·L-1的ABTS母液。精密称取K2S2O80.378 4 g，加10 mL蒸馏水定容得浓度为2.6 mmoL·L-1的K2S2O8母液。将5 mL 7.4 mmoL·L-1的ABTS母液与88 μL 2.6 mmoL·L-1的K2S2O8母液混匀，静置12～16 h，配成ABTS工作液。

2.4.2 测定方法及结果 无水乙醇50 μL、ABTS工作液100 μL，记为A0管；将“2.3.1”项下供试品溶液稀释成所需浓度并取50 μL、 ABTS工作液100 μL，记为A1管，避光反应6 min，于734 nm处测定吸光度。平行测定3次。按公式2计算各供试品ABTS+清除率和IC50值。

(公式2)

表4结果表明，湿生扁蕾各提取物对ABTS+自由基均有显著的清除作用。IC50越小说明供试品清除能力越强，正丁醇提取物对ABTS+自由基清除能力最强。不同部位提取物清除ABTS+自由基能力的大小顺序依次为：正丁醇提取物>95%乙醇提取物>乙酸乙酯提取物>水提物。

表4 湿生扁蕾各提取物ABTS+清除率结果

2.5 Pearson相关性分析[9]采用 SPSS 17.0统计软件将各提取物中当药黄素、当药醇苷、木樨草素的含量与DPPH·清除能力、ABTS+清除能力进行双变量相关分析。Pearson相关系数如表5所示，相关系数越大，表明两者相关性越高。结果表明，各提取物的DPPH·清除能力、ABTS+清除能力与当药醇苷和木犀草素含量均呈显著正相关(P<0.05)，与当药黄素分别呈无直线相关和低度负相关。这表明当药醇苷和木犀草素含量对湿生扁蕾的抗氧化活性起决定性作用。其中，DPPH·清除能力、ABTS+清除能力均与当药醇苷相关性最高，相关系数为0.994、0.823；与木犀草素相关性次之，相关系数分别为0.875、0.746。

表5 抗氧化活性与主要成分含量Pearson相关性分析结果

2.6 灰色关联分析[10]由于自由基清除率的IC50越小代表清除作用越强， 因此先将药效指标 IC50值转化为倒数，并将数据矩阵采用均值化法进行无量纲化处理，计算IC50倒数序列与3个成分含量相关序列绝对差值数据，按照参考文献中公式计算二级最大差和最小差得到关联系数，根据关联系数计算关联度。具体计算过程再不赘述。关联度与相关性呈正比，当关联度>0.6，则判定有相关性。如表6所示，与DPPH·清除能力和ABTS+清除能力的关联度排序均为木犀草素>当药醇苷>当药黄素，且关联度均>0.6。其中木犀草素与DPPH·清除能力和ABTS+清除能力的关联度最高，分别为0.791、0.767；当药醇苷与DPPH·清除能力和ABTS+清除能力的关联度次之，分别为0.709、0.758；以上结果说明相较于当药黄素，木犀草素和当药醇苷含量对湿生扁蕾的抗氧化活性影响更大，这与文献报道木犀草素和当药醇苷具有抗氧化作用相符合[11-12]。

表6 抗氧化活性与主要成分含量的关联系数与关联度结果

3 讨论

本实验首先采用HPLC法检测了湿生扁蕾提取物中当药黄素、当药醇苷和木犀草素含量，不同溶剂浸出结果表明，各提取物中当药黄素含量为乙酸乙酯提取物>95%乙醇提取物>水提物>正丁醇提取物；当药醇苷含量为95%乙醇提取物>正丁醇提取物>乙酸乙酯提取物>水提物；木犀草素含量为正丁醇提取物>95%乙醇提取物>乙酸乙酯提取物>水提物。其次，通过DPPH·清除实验、ABTS+自由基清除实验考察了不同提取物的体外抗氧化能力，结果表明，各提取物均有良好的抗氧化能力，但差异明显。综合来看以95%乙醇提取物和正丁醇提取物抗氧化能力最佳。为了验证各提取物中当药黄素、当药醇苷和木犀草素含量与抗氧化能力的相关性，采用Pearson双变量相关分析法和灰色关联法对当药黄素、当药醇苷和木犀草素含量与其抗氧化活性进行了相关性和关联度分析，结果表明，当药醇苷含量与DPPH·清除能力、ABTS+清除能力相关性较好，相关系数R2分别为0.994、0.823；而木犀草素相关系数分别为0.875、0.746。这一结果与之前的含量测定结果和抗氧化能力检测结果相符，湿生扁蕾95%乙醇提取物和正丁醇提取物中所含当药醇苷和木犀草素高，其抗氧化能力越强，说明当药醇苷和木犀草素含量很有可能是湿生扁蕾发挥抗氧化活性的物质基础。

本实验为湿生扁蕾体外抗氧化活性的药效物质基础研究奠定了一定基础，也为其进一步开发利用提供了理论依据。