两种黄芪剂量补阳还五汤对海绵体神经损伤性大鼠勃起功能障碍的治疗效果

周康，叶妙勇，赵凡，马轲，吕伯东，许增宝

(1.浙江中医药大学第二临床医学院，杭州 310053；2.温岭市第一人民医院泌尿外科，浙江温岭 317500；3.南通大学附属医院泌尿外科/男科，江苏南通 226001；4.浙江中医药大学附属第二医院泌尿男科，杭州 310005；5.浙江省中医药重点实验室/男科实验室，杭州 310053；6.浙江中医药大学泌尿男科研究所，杭州 310005；7.湖州市中医院，浙江湖州 313000)

勃起功能障碍(erectile dysfunction，ED)是前列腺癌根治术(radical prostatectomy，RP)后最为常见的长期并发症[1]。尽管目前RP在不断改进，但即使采用保留双侧神经和微创RP仍不可避免地出现一定程度的海绵体神经(cavernous nerves，CN)损伤或神经失用，进而导致ED[2]。5型磷酸二酯酶抑制剂(phosphodiesterase type 5 inhibitors，PDE5i)通常作为RP后ED的一线治疗，然而据调查显示，RP后ED患者于术后服用3～36个月PDE5i，其国际勃起功能指数-5(IIEF-5)评分没有显著变化(P＝0.87)[3]，可见PDE5i对RP后ED治疗效果较为局限。从中医角度来看，笔者所在团队前期研究得出“气血失和”可能是勃起功能障碍的基本病因这一结论[4-5]，故治以益气活血。

补阳还五汤出自《医林改错》，由清代医家王清任所创，功主益气活血，且近来大量研究表明补阳还五汤具有神经保护功能[6-7]。胡卫东等[8]运用加味补阳还五汤治疗糖尿病性ED，取得较好的疗效，但细观文献中所用黄芪量仅为30 g，而原方中所记载的120 g相差甚远。那么，补阳还五汤中黄芪剂量的高低与其神经保护功能从而改善勃起功能障碍是否密切相关，值得深入研究。本文就这一问题，探讨不同黄芪剂量补阳还五汤对海绵体神经损伤性大鼠勃起功能障碍的治疗效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

32只8周龄SPF级雄性SD大鼠，体重(200±15)g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，【SCXK(沪)2017-0005】，并由浙江中医药大学实验动物中心饲养，【SYXK(浙)2019-0022】。饲养期间给予啮齿类动物标准颗粒饲料及自由饮水，控制温度(23±2)℃、湿度60%，12 h循环灯光。实验过程中对动物的处理符合2006年科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》，所有操作均符合实验动物伦理学要求(伦理审批号：IACUC-20190909-26)。32只大鼠随机分为4组，即假手术组、模型组、30 g组(模型 +30 g黄芪补阳还五汤)、120 g组(模型 +120 g黄芪补阳还五汤)，每组8只。

1.1.2 药物

补阳还五汤中：赤芍：15 g、桃仁：15 g、当归：15 g、川芎：15 g、地龙：15 g、红花：6 g，30 g组黄芪为30 g，120 g组黄芪为120 g(所有药材由浙江中医药大学名中医馆提供)。将所有中药浸于10倍体积纯水中30 min，然后煮沸2次，每次约1 h，合并水煎液后，浓缩至水煎液浓度为1 g/mL，4℃冰箱保存备用。

1.1.3 主要试剂与仪器

戊巴比妥钠(上海优宁维生物科技股份有限公司，批号：abs47047376)，Masson三色染色试剂盒购于南京建成科技有限公司(批号：D026-1-3)，神经型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)抗体(Abcam，批号：ab15280)，神经丝蛋白轻链多肽(neurofilament light polypeptide，NF-L)抗体(Abcam，批号：ab134460)，生长相关蛋白43(growth associated protein 43，GAP-43)抗体(CST，批号：5307S)。

MP160型16通道生理记录分析系统购于美国BIOPAC公司；Master-8可编程刺激器购于以色列AMPI；SDS-PAGE 垂直电泳槽(MP-8001，北京凯元伯乐生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模及干预方法

参考课题组前期研究的造模方法[9]，将SD大鼠腹腔内注射3%戊巴比妥钠进行麻醉。剃除腹腔部绒毛，并用碘酒进行术前消毒。于大鼠下腹部中线处作一纵行切口，暴露前列腺组织。在外科显微镜下于背侧前列腺外侧叶表面找到盆腔神经节及其发出的海绵体神经，利用止血钳钳夹海绵体神经2 min，继而还原周围组织正常解剖结构并逐层缝合关服。术后抗生素喂养5 d。假手术组分离出海绵体神经后，不作钳夹处理，余同上。术后5 d起开始给药，给药剂量根据常用实验动物及人的体表面积比例进行剂量换算，给以12.8 g/kg对应黄芪剂量的补阳还五汤灌胃，假手术组与模型组均予以等量生理盐水灌胃。每天1次，连续30 d。

1.2.2 ICP检测

灌胃30 d后，腹腔内注射3%戊巴比妥钠进行麻醉后仰卧固定，如造模方法中所操作暴露海绵体神经；阴茎包皮纵行切口，分离皮肤与白膜，暴露阴茎海绵体，插入25G金属针头后连接PE50管，置管连接于压力换能器，以测定阴茎海绵体内压。双极电钩刺激海绵体神经，记录ICP，电刺激参数：5 V，15 Hz，5 ms，刺激持续时间 1 min，每次刺激间隔5 min[10]。

1.2.3 样本收集

ICP测定后，使用眼科剪离断阴茎根部，分离阴茎龟头部分，取阴茎，于PBS中冲洗，去除海绵体内血液。冲洗完的阴茎组织分为三段，一段在预冷PBS中分离去除尿道、筋膜后放入-80℃冰箱保存，用于后续Western Blot检测；剩余阴茎组织放入4%多聚甲醛中固定。

1.2.4 Masson染色

经聚甲醛溶液固定的阴茎组织，常规石蜡包埋切片，蒸馏水润湿玻片30 s，核染液染色60 s，丢弃，冲洗液冲洗30 s。浆染液染色30 s，丢弃，冲洗液冲洗30 s。黄色分色液分色8 min左右弃去分色液，直接用蓝色复染液染色5 min左右，丢弃，使用无水乙醇冲洗干净，载玻片吹干后使用封片剂封片，显微镜下观察。

1.2.5 免疫荧光检测

经聚甲醛溶液固定的阴茎组织，常规石蜡包埋切片，石蜡切片常规脱蜡至水，PBS冲洗3次，每次3 min；3%H2O2室温孵育 10 min，PBS 冲洗；微波温和修复15 min；PBS冲洗3次；5%山羊血清室温封闭30 min；按1∶200稀释比例分别加入抗nNOS、NFL、GAP43一抗，DAPI行细胞核染色，4℃过夜后分别加入1∶1000稀释的荧光二抗，避光孵育1 h，滴加抗荧光衰减封片剂封片后置于4℃条件下保存，荧光显微镜下观察拍片，并用Image J软件测定阳性区域的面积。

1.2.6 Western Blot检测

取剩余阴茎组织研磨成匀浆，加入RIPA裂解液置于冰上裂解30 min后，12 000 r/min 4℃离心15 min。离心获得蛋白用BCA法测定浓度，加入5×蛋白上样缓冲液95℃变性10 min；10%SDSPAGE凝胶电泳分离蛋白，电泳后的蛋白样品转移到PVDF膜上，然后用5%的脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST洗膜3次后加入相应一抗4℃孵育过夜；次日TBST洗去一抗，加入对应种属的二抗，室温孵育1 h，TBST洗膜3次，去离子水洗膜 1次之后，用ODYSSEY双色红外激光成像系统扫膜，并使用Image Studio Ver 2.0软件处理实验结果。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 海绵体神经解剖位置、夹损及阴茎海绵体内压测定

盆神经节于两侧前列腺背外侧方，呈“人”字形，其传出神经即为海绵体神经(图1a)；海绵体神经夹损(图1b)；ICP测定方法(图1c)。

图1 海绵体神经解剖位置、夹损及阴茎海绵体内压测定Note.a.anatomic location of cavernous nerve.b.ED caused by cavernous nerve clipped.c.ICP determination.Figure 1 Anatomical location of cavernous nerve，clip injury and ICP measurement

2.2 大鼠阴茎海绵体组织Masson三色染色

各组大鼠阴茎海绵体组织Masson三色染色中，大鼠海绵窦内平滑肌如图2a，红色箭头所示。与假手术组比较，模型组大鼠阴茎海绵体平滑肌面积/胶原面积显著下降(P＜0.01)；与模型组比较，30 g组及120 g组大鼠阴茎海绵体平滑肌面积/胶原面积明显提高(P＜0.01)；与30 g组比较，120 g组大鼠阴茎海绵体平滑肌面积/胶原面积提高有统计学意义(P＜0.05)(见图2b)。

2.3 大鼠阴茎海绵体内压测定

与假手术相比，模型组大鼠勃起时ICP具有显著性差异(P＜0.01)，即造模成功，与模型组相比，30 g组与120 g组ICP均有显著提高(P＜0.01)，与30 g相比，120 g组大鼠 ICP明显升高(P＜0.05)(见图3)。

2.4 大鼠海绵体神经免疫荧光检测

相对于假手术组，模型组大鼠海绵体神经中nNOS、NF-L、GAP43含量在海绵体神经损伤后显著降低(P＜0.01)，经补阳还五汤治疗后，30 g组和120 g组大鼠阴茎海绵体神经中nNOS、NF-L、GAP43表达量显著增高(P＜0.01)，且120 g组表达量显著高于30 g组(P＜0.01)(见图4)。

2.5 各组大鼠海绵体组织nNOS、NF-L、GAP43含量变化

与假手术组相比，模型组大鼠海绵体组织中nNOS、NF-L显著下降(P＜ 0.01)，GAP43显著提高(P＜0.01)；与模型组相比，30 g组和 120 g组nNOS、NF-L、GAP43含量显著升高(P＜ 0.01)；与30 g组相比，120 g组 nNOS、NF-L、GAP43含量明显增加(P＜0.01)(见图5)。

图2 Masson三色染色显示大鼠阴茎海绵体组织中平滑肌和胶原纤维含量(n＝3)Note.The red arrows indicate smooth muscles.Compared with sham operation group， ＆＆P＜ 0.01.Compared with model group， ∗∗P＜ 0.01.Compared with group 30 g，#P＜ 0.05， ##P＜ 0.01.(The same in the following figures)Figure 2 Masson trichrome stain shows the content of smooth muscle and collagen fibers in the spongy tissues of rat penises(n＝3)

图3 各组大鼠海绵体内压测定结果(n＝3)Figure 3 ICP measurement results in each group(n＝3)

图5 各组大鼠海绵体nNOS、NF-L、GAP43表达变化(n＝3)Figure 5 Expression changes of nNOS、NF-L and GAP43 in cavernous of rats in each group(n＝3)

3 讨论

海绵体神经损伤属于周围神经损伤，祖国医学中无此病名，但据其临床表现症状，与中医所谓“痹症”和“痿证”颇为相似，当属经络伤之范畴。《广嗣纪要·协期》曰：“气至则血至，阴茎则勃起刚”，可见男性的勃起需要健全的血气运行[11]，反而言之，当气血运行受阻则“血少不充，阴茎不怒”。RP后ED病机多为经络不通，经气不续，气虚血滞，以致阴茎痿而不用。针对此病机，可考虑将益气活血法运用于临床治疗RP术后ED。且中药药理学研究表明，益气活血方剂具有改善微循环、血液流变学、抗氧化等药理作用，可见，益气活血法或可于多方面调节、纠正RP后ED。

补阳还五汤出自《医林改错》，是经典的益气活血方，大量研究结果表明，补阳还五汤可通过SIRT1/VEGF通路、减少自然杀伤细胞浸润、改善微循环等多个方面修复大鼠神经损伤[12-14]；Pan等[15]通过手术造成大脑中动脉闭塞性神经损伤大鼠模型，随后予以补阳还五汤灌胃干预，灌胃后第7天与第14天大鼠神经损伤明显改善；刘青龙[16]以补阳还五汤口服加药浴的方式干预坐骨神经损伤大鼠模型，干预后第2、4、6周，模型组大鼠坐骨神经传导速度较对照组显著增快；且临床数据显示，补阳还五汤能够明显改善缺血性卒中患者神经功能，经治疗后NIHSS评分、ADL评分显著提高[17]。也有学者通过研究证实，补阳还五汤能够改善博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化[18]。而临床上使用补阳还五汤治疗勃起功能障碍也有报道，胡卫东等[8]运用加味补阳还五汤治疗糖尿病性ED，亦取得较好的疗效，但细观文献中所用黄芪量仅为30 g；且中华人民共和国药典中生黄芪最大用量也仅为30 g[19]，而原方中重用黄芪120 g；仝小林认为“重剂起沉疴”，治疗ED时一般重用生黄芪120 g[20]大补元气，令气旺血行。那么黄芪用量是否与其神经保护效果、改善勃起效果具有密切相关性，值得研究。

本实验通过钳夹SD大鼠海绵体神经造成ED模型后予以不同黄芪剂量的补阳还五汤灌胃干预，使用ICP测定评估大鼠勃起功能；实验结果表明：模型组大鼠ICP水平显著降低，而相对于模型组而言，30 g组与120 g组大鼠ICP明显升高，且120 g组高于30 g组，这表明了补阳还五汤确实能改善大鼠勃起功能障碍，且120 g组治疗效果优于30 g组。从分子水平来看，模型组大鼠阴茎海绵体组织NF-L、nNOS、GAP43表达量显著降低，阴茎海绵体组织胶原纤维面积增大，补阳还五汤灌胃干预后，30 g组与120 g组大鼠nNOS、NF-L、GAP43表达量基于模型组有所提高，且120 g组与30 g组的差异有统计学意义。nNOS可以通过催化左旋精氨酸来产生NO，而NO则为体内主要的舒张血管的物质，通过舒张神经滋养血管进而发挥保护神经的作用[21-22]，GAP43在神经元支撑、营养、保护、轴突再生等方面起到重要的作用[23-24]，在神经修复过程中表达上调，被认为是神经损伤后再生的重要指标[25]；NF-L作为细胞骨架组成主要组成成分，对于维持神经形态具有十分重要的作用[26]，神经损伤后失去营养作用，不能维持正常形态导致神经细胞结构发生改变，最终导致NF-L表达量下降。本研究中各组大鼠nNOS、NF-L、GAP43表达量的变化为补阳还五汤在神经保护再生方面作用提供了确切依据，也说明了补阳还五汤可通过保护、修复海绵体神经从而改善勃起功能障碍。然而从Masson染色中可看到，模型组大鼠海绵体平滑肌含量下降，胶原含量增加，而30 g组与120 g组大鼠阴茎海绵体胶平滑肌含量增加，原纤维含量降低，海绵体平滑肌在海绵体组织中占45%，其作为阴茎的重要组成部分，在阴茎勃起的启动和维持中发挥关键作用[27]，Cho等[28]提出海绵体损伤是引起阴茎纤维化的重要因素，与本实验结果相符；同时也意味着补阳还五汤在保护修复神经的同时还能在一定程度上改善阴茎组织纤维化从而改善勃起功能，但其确切机制有待深入研究。

综上所述，补阳还五汤可以通过神经修复有效改善大鼠勃起功能障碍并能在一定程度上改善阴茎海绵体组织纤维化，且《医林改错》原方所用高剂量黄芪用量的补阳还五汤治疗效果更为显著。