化感水稻内生真菌的分离鉴定及其发酵产物的生物学效应研究

陈颐辉 张宽朝 滕斌 张琛 张瑛

摘  要：以化感水稻品种‘PI312777’‘6173’和‘6180’为研究对象，从水稻根、茎和叶中分离获得70株内生真菌，采用形态学观察和rDNA-ITS区序列分析，对内生真菌进行分类鉴定。进一步以化感水稻‘PI312777’分离得到的粘红酵母和塔宾曲霉为试验菌株，通过不同稀释倍数的真菌发酵液对非化感水稻进行MS半固体培养基育苗试验，研究化感水稻内生真菌发酵产物对非化感水稻萌发率、株高等形态指标及苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性的影响。结果表明，从供试化感水稻品种中共分离得到17种内生真菌，经rDNA-ITS系统发育树分析鉴定为10个属，这些内生真菌主要分布在曲霉属（Aspergillus）（29.63%）、青霉属（Penicillium）（16.67%）和镰刀菌属（Fusarium）（12.96%）。不同稀释浓度塔宾曲霉发酵液对水稻幼苗生长均有促生作用，其中50倍稀释浓度处理可显著提高水稻幼苗的株高、根长及POD酶活性。粘红酵母菌发酵液5倍稀释浓度可显著提高水稻幼苗的PAL酶活性并对水稻幼苗有促生作用。稗稻共生条件下，塔宾曲霉和粘红酵母发酵稀释液对水稻均有促生效应。本研究可为化感水稻内生真菌进一步应用于水稻生产实践提供有益指导。

关键词：内生真菌;化感水稻;种类鉴定;酶活性

中图分类号：S511;Q93      文献标识码：A

Abstract： Using allelopathic rice ‘PI312777’ ‘6173’ and ‘6180’ as the materials， 70 endophytic fungi were isolated from the roots， stems and leaves， and were further classified and identified by morphologic observation and rDNA ITS se-quence analysis. To study the effects of fungal fermentation products on the morphological indexes such as germination rate， stem height and phenylalanine ammonia lyase， catalase and peroxidase changes， Rhodotorula mucilaginosa and Aspergillus tabiensis isolated from allelopathy rice ‘PI312777’ were used as the experimental strains and their fermentation broth of different concentrations were used to carry out MS semi-solid medium seedling experiment on non-allelopathy rice. The results showed that 17 isolates of endophytic fungi and 10 genera were identified through rDNA-ITS sequence analysis. Aspergillus， Penicillium and Fusarium were the dominant species in allelopathic rice with the relative isolate frequency 29.63%， 16.67% and 12.96%， respectively. Different concentrations of A. tabiensis fermentation broth all promoted the growth of rice seedlings， among which the 50 times diluted concentration treatment significantly improved plant height， root length and POD activity of rice seedlings compared with the control treatment. High concentration of R. mucilaginosa fungus fermentation broth improved PAL activity of rice. Under the symbiotic condition of barnyard grass and rice， A. stabiensis and R. mucilaginosa both had promoting effects on the growth of non-allelopathic rice. The finding of this study could provide useful guidance for the further application of allelopathic endophytes in rice production.

Keywords： endophytic fungi; allelopathic rice; species identification; enzyme activity

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.04.029

植物內生真菌（endophytes）是指在某一时期生活在宿主植物组织内，却不对宿主产生明显有害症状，可与宿主植物建立互惠共存关系的一类微生物。植物为这些真菌提供生存环境，并为其提供光合产物和矿物等营养物质;内生真菌则产生具有抗菌、抗氧化、抗虫等生物活性的代谢产物，这些次生代谢产物能够刺激植物生长发育，提高寄主植物抵御病害的能力，并且增加宿主植物的化感作用[1-3]。

水稻作为我国重要的禾谷类作物，具有丰富的内生真菌资源，其种质资源中存在具有化感潜力的品种[4]。化感水稻合成分泌的酚酸类、醌类、萜烯类等物质具有增强寄主植物应对生物和非生物胁迫的能力[5-6]，而且其内生真菌在与水稻长期共生的过程中，往往会形成一些新的化合物，同样会对水稻生理代谢产生各种作用和影响[7]。因此，利用化感水稻内生真菌，不仅能有效提高水稻产量，还可避免化学农药引起的环境污染，具有良好的应用前景。

目前，水稻化感的研究主要集中于遗传特性，化感物质分离鉴定、作用方式及其机制等方面[5]。水稻内生真菌研究多限于内生联合固氮菌以及水稻病害生防菌方面的筛选与应用[7]，而对化感水稻内生真菌的分类鉴定研究则很少。因此，发掘利用化感水稻内生真菌资源，对于促进水稻生长、提高水稻产量具有积极意义。近年来，国内外相关学者采用形态与分子学相结合的方法对植物内生菌分类鉴定进行了研究。rDNA-ITS序列分析与传统形态学相结合的方法，已被成功应用于多种植物内生真菌的分类鉴定[8-9]。本研究以4个水稻品种为材料，对其根、茎和叶组织中的内生真菌进行了分离和种类鉴定，并采用来自化感水稻的内生真菌，研究不同浓度真菌发酵液对非化感水稻生长和生理特性的影响。本研究可为进一步挖掘利用化感水稻内生真菌资源，阐明水稻内生真菌的生理生态功能提供基础资料。

1  材料与方法

1.1  材料

供试材料：安徽省农业科学院水稻所提供的3种化感水稻品种‘PI312777’‘6173’‘6180’，以及非化感水稻品种‘嘉兴8号’以及稗草种子[10-11]。

培养基及试剂：水稻育苗采用MS培养基，真菌培养采用PDA培养基[7]，灭菌后加入150 μg/mL青霉素和120 μg/mL链霉素以抑制细菌生长。青霉素、链霉素、乙醇、次氯酸钠等分析纯试剂购于国药集团，DNA聚合酶Taq酶、凝胶回收试剂盒均购于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2  方法

1.2.1  内生真菌的分离纯化  取水稻苗期的根、茎和叶片分别剪成1 cm长的3个小段，在无菌环境下，用无菌水将材料冲洗2～3次后取出，放入75%的乙醇中清洗30 s。随后将样品分别置于不同浓度的次氯酸钠溶液（1%、2.5%、5%）中清洗1 min，取出后立即用无菌水漂洗4～5次[7]。随后将无菌样品分为2份，其中一份用组织分离法直接转接到含有青霉素和链霉素的PDA培养基上，26 ℃下培养7 d;另一份用研钵将材料研磨成匀浆后，方法同上。将分离得到的不同内生真菌接种到纯化PDA培养基上，纯化2次后获得单菌落，置于4 ℃冰箱冷藏待用。

1.2.2  内生真菌的鉴定  将纯化菌株接种至PDA培养基上，置于25 ℃培养，观察形态特征，包括菌落形态、颜色、子实体和产孢结构。同时通过扩增分析真菌rDNA的ITS1序列，进行分子鉴定，具体如下：收集菌丝，用改良的CTAB法提取菌株基因组DNA[12]。采用真菌通用引物ITS1（5-TCCG TAGGTGAACCTGCGC-3）和ITS4（5-TCCTCCGC TTATTGATATGC-3）扩增其5.8S rDNA-ITS序列[9]。PCR扩增反应体系为50 μL，含DNA模板（50～ 500 ng/μL）2 μL，ITS1和ITS4（10 mmol/L）各2 μL，10×PCR buffer 5 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，Taq聚合酶（5U/μL）1 μL，ddH2O 37 μL。反应程序：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35个循环;72 ℃ 10min。PCR产物经1.3%琼脂糖凝胶电泳检测后回收、克隆并测序。测序结果在NCBI的Gen Bank数据库中进行Blast比对。

1.2.3  不同浓度化感水稻内生真菌发酵液对水稻生长影响的测定  在上述研究结果基础上，选择从化感水稻品种‘6173’中分离到的特属内生真菌粘红酵母和塔宾曲霉，用于制备真菌发酵液。将无菌抽滤所得发酵液用无菌水分别稀释成5、10、50倍3个浓度梯度。随后，将非化感水稻品种‘嘉兴8号’置于高温灭菌后的培养皿中催芽至露白，继续在26 ℃培养箱中培养，每24 h施加不同浓度发酵液，待培养7 d后，对水稻种子萌发率、幼苗株高、根长及鲜重等形态指标进行测定。

向水稻‘嘉兴8号’幼苗（3叶期）施加内生真菌发酵液，并于48 h后测定水稻幼苗的过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性。POD酶活性采用愈创木酚法测定[13]，CAT酶活性采用紫外吸收法测定，PAL酶活性采用分光光度法测定[14]，每个处理重复3次。

1.2.4  内生真菌生物学特性分析  以化感水稻‘6173’、非化感水稻‘嘉兴8号’和稗草为研究材料，在温室盆栽条件下，将‘嘉兴8号’与稗草共栽培并施加目标内生真菌的发酵液处理作为试

验组，再以‘6173’与稗草、‘嘉兴8号’与稗草共同播种栽培作为对照组。待水稻生长至分蘖期时，测量3种植株材料的出苗率、分蘖数、株高、叶宽、根长、生物量等形态指标，每个处理重复3次。

1.3  数据处理

采用SPSS 24.0软件进行数据统计，应用Duncan’s多重比较方法对多组样本间平均数进行比较，按照显著性水平P<0.05判断差异显著性;采用Excel软件进行制图。

2  结果与分析

2.1  化感水稻内生真菌的分离结果

分离所得的内生真菌经2～3次纯化后，最终从4种水稻材料中分离到70株内生真菌。从表1可以看出，化感水稻与非化感水稻所携带的内生真菌存在数量间差异。其中，从‘6173’分離到的内生真菌总数最多，达23株;‘PI312777’次之，为18株。根、茎组织方面，从‘6173’中分离到的内生真菌最多，分别为8和10株;叶片组织方面，从‘PI312777’分离到的内生真菌最多，为6株。在4种化感水稻的根、茎、叶组织中分别分离到24、29和17株内生真菌，占总分离真菌数的相对分离比率分别为34.29%、41.43%和24.28%，表明内生真菌在化感水稻组织中的分布存在组织差异性。

2.2  水稻内生真菌种类鉴定

通过菌落和形态学观察，并对分离获得的70株内生真菌进行rDNA-ITS序列分析，在4种供试水稻品种中共分离、鉴定到17种内生真菌，这些真菌分属3个亚门，10个属。这些内生真菌多数属于子囊菌亚门和盘菌亚门，它们主要属于这些亚门中的曲霉属、青霉属、镰刀菌属等，还有部分属于木霉属、丝核菌属和酵母属的真菌（表2）。其中，从化感水稻品种‘PI312777’和‘6173’中分离得到的内生真菌种类最多，分别为16种和14种。4个水稻品种中曲霉属真菌所占比例分别为‘PI312777’27.78%、‘6173’26.09%、‘6180’46.15%、‘嘉兴8号’37.5%，表明曲霉菌是水稻内生真菌中的优势菌群，其次是青霉属共13株（18.57%）。从表2还可看出化感与非化感水稻中内生真菌种类存在一定差异，镰刀菌属、黑曲霉、粘红酵母、塔宾曲霉和麦角菌存在于化感水稻中，这其中黑曲霉是自然界广泛分布的曲霉属真菌，麦角菌为常见的植物病原真菌，根据上述情况，选择来自化感水稻的内生真菌粘红酵母和塔宾曲霉进行下一步的生物学效应实验。

2.3  不同浓度化感水稻内生真菌发酵液对水稻生长的影响

从表3可以看出，与对照相比，不同浓度的塔宾曲霉发酵液对水稻幼苗的株高、根长和鲜重均有明显促进作用，且随着发酵液浓度的降低，水稻幼苗表现出更好的生长态势。在塔宾曲霉发酵液稀释50倍处理组中，水稻幼苗株高达9.42 cm，显著高于对照23.92 %，根长为5.67 cm，高于对照38.30%，且单株平均鲜重也高于对照18.95%;从粘红酵母发酵液处理对水稻幼苗的生长影响来看，粘红酵母发酵液稀释5倍处理组中，水稻幼苗各项生理指标均高于对照，差异显著。10倍和50倍稀释倍数发酵液处理组间幼苗株高、根长、鲜重，与对照相比，仅10倍稀释处理组幼苗株高显著长于对照，其他指标均无显著差异。不同稀释浓度处理组之间比较，5倍稀释倍数发酵液处理组水稻幼苗株高显著高于其他处理组，并且高于对照。以上结果表明，塔宾曲霉和粘红酵母发酵液对水稻的生长具有促进作用，其中塔宾曲霉发酵液50倍稀释浓度的作用效果最好。

2.4  不同浓度塔宾曲霉和粘红酵母发酵液对水稻不同酶活性的影响

苯丙氨酸解氨酶（PAL）是植物酚类代谢的限速酶。已有研究表明，在逆境胁迫下，水稻化感作用的强弱与其酚类化合物的总量和种类有关，因此苯丙氨酸解氨酶活性的调节可以诱导水稻化感作用的变化[15]。从图1可以看出，塔宾曲霉处理组水稻幼苗的PAL酶活性略低于对照，但与对照无显著性差异;3组不同稀释浓度发酵液处理组之间酶活性差异也不显著，表明塔宾曲霉发酵液处理不利于水稻幼苗PAL酶活性的提高。经不同浓度的粘红酵母发酵液处理后，非化感水稻的PAL酶活性均显著高于对照，并且不同稀释倍数的粘红酵母发酵液处理组间PAL酶活性差异显著，其中粘红酵母发酵液5倍稀释液处理组酶活性上升最迅速，其酶活性为对照的2.32倍，表明粘红酵母菌发酵液5倍稀释浓度处理对水稻化感作用的诱导效应最强。

从图2可知，不同稀释倍数的塔宾曲霉发酵液处理均对水稻幼苗POD酶活性产生积极的影响，3组水稻POD酶活性均显著高于对照;3组不同浓度处理之间，水稻幼苗POD酶活性差异均不显著;其中最大稀釋倍数的塔宾曲霉发酵液也可显著提高水稻幼苗POD酶活性，酶活性为对照的1.36倍。以上结果表明，塔宾曲霉发酵液能够提高水稻对胁迫的抵抗能力。粘红酵母方面，各发酵液处理组的POD酶活性与对照相比差异均不显著，但粘红酵母发酵液5倍稀释浓度处理组的幼苗POD酶活性显著高于其他2组，表明高浓度的稀释发酵液对水稻POD酶活性有促进效应。综合以上试验结果，认为塔宾曲霉发酵液50倍稀释浓度对水稻的生长和生理指标的影响最为显著，粘红酵母发酵液5倍稀释浓度能提高水稻PAL酶活性，提高水稻的化感潜力。

2.5  稗稻共生条件下塔宾曲霉及粘红酵母发酵液对水稻幼苗生长的影响

从表4可以看出，化感水稻‘6173’的出苗率显著高于其他3个处理组，施加内生菌发酵液A和B试验组的‘嘉兴8号’出苗率也显著高于其组内对照。其中，粘红酵母发酵液5倍稀释液处理水稻的出苗率高于对照34.00%，而处理组中植株的分蘖数无明显变化。施加塔宾曲霉发酵液50倍稀释液的‘嘉兴8号’水稻苗各项生理指标均显著高于对照，其单株株高和根长分别高于C处理组16.82%和7.37%。以上结果表明，稗稻共生条件下，塔宾曲霉和粘红酵母发酵产物对水稻幼苗生长具有较好的促生作用。

3  讨论

3.1  内生真菌的种类和分布

本研究中，供试水稻内生真菌分离获得比率的高低为：曲霉属>青霉属>镰刀菌属，表明曲霉属是水稻的优势菌群，而曲霉属和镰刀菌属真菌作为土壤中常见的真菌类群，其原因很可能是在水稻生长过程中从土壤传播定殖到水稻组织中。田新莉等[16]从几种常规水稻品种中分离内生真菌结果表明，多数内生真菌为镰刀菌属、青霉属及曲霉属，其中镰刀菌属为优势菌群，这些内生菌能够产生抑制水稻病原菌的次级代谢产物[17-19]，其代谢产物也可能会通过某种代谢途径提高植物体的化感作用，进而影响伴生杂草的生长[20]。本研究还从化感水稻‘PI312777’‘6173’中均分离到粘红酵母。粘红酵母已被证实能够以苯丙氨酸为唯一碳源、氮源大量合成苯丙氨酸解氨酶，它是一种典型的胞内诱导酶，能参与植物抗病、抗虫害、抗逆境的生理作用，是植物体内酚酸类物质代谢的关键酶[21]，它与水稻化感作用增强，酚酸类化感物质增加有密切的联系[22-23]。此外，本研究中仅从化感水稻中分离到了麦角菌，麦角菌代谢产物中的麦角碱毒素被认为对伴生植物表现出较强的化感效果[24]。以上表明，本研究所发现的内生真菌种类较为丰富，可能参与形成了水稻的化感效应。

3.2  塔宾曲霉和粘红酵母发酵液对水稻生长的影响

本文从实际应用出发，选择不同稀释浓度，着重研究了塔宾曲霉和粘红酵母2种内生真菌发酵液对水稻生长生理的影响。研究发现塔宾曲霉发酵液能明显促进水稻幼苗生长，提高水稻幼苗生物量。塔宾曲霉发酵液处理的水稻幼苗POD酶活性均高于对照组，这可能是因为其影响了水稻体内氧化还原系统的平衡，使水稻体内活性氧自由基维持在较低水平，从而能够抑制细胞膜脂过氧化，维持膜的稳定性，保持细胞正常生长代谢[25-26]。PAL作为水稻酚酸类化感物质合成的关键酶，前期研究表明，逆境条件下水稻化感作用的增强与PAL酶活性升高有关，而高活性的PAL有利于促进酚酸类物质的合成和分泌[27-28]。本研究结果还发现，粘红酵母发酵液5倍稀释液能显著提高幼苗期非化感水稻的PAL酶活性。盆栽试验结果也表明，从化感水稻‘6173’中筛选出的2株内生真菌对非化感水稻‘嘉兴8号’均有一定的促生效应，这可能是因为真菌代谢物会增强植株的抗逆性和增强其营养生理水平[16-17， 28]，塔宾曲霉发酵液50倍稀释液对水稻的生长表现出直观的促进作用;粘红酵母发酵液5倍稀释液通过诱导水稻PAL活性，处理组中‘嘉兴8号’长势与化感水稻‘6173’持平。以上结果表明，塔宾曲霉和粘红酵母内生真菌发酵产物对水稻生长有促进作用。

4  结论

本研究发现，内生真菌的种类和群落结构在化感水稻不同组织部位存在差异。通过经典的形态分类鉴定并结合内生真菌的rDNA-ITS序列进行分析，从供试水稻品种中共分离到17种内生真菌，这些真菌分属3个亚门，10个属。在所分离的内生真菌中，曲霉属真菌为化感水稻优势菌群，其分离率达29.63%。从地方化感水稻品种‘6173’中分离筛选到的塔宾曲霉属内生真菌和粘红酵母属真菌菌株能够促进水稻生长和提高非化感水稻的化感潜力，表明化感水稻内生真菌具有作为新型植物益生菌新资源的开发潜力，可进一步应用于农业生产中，从而减少化肥和农药的使用量，促进农业的可持续发展。

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责任编辑：谢龙莲