冠心病患者外周血ATG-5、ATG-7水平与冠状动脉病变程度、心率变异性及斑块易损性的关系

李巍 李彦明

(河南大学淮河医院，河南 开封 475000 1 心内科； 2 心电图科)

脂质沉积、炎症反应、氧化应激等都是引起冠心病的重要因素[1]，而巨噬细胞在其中扮演着十分关键的角色，通过摄取大量氧化型低密度脂蛋白并向泡沫细胞转化，释放大量炎性递质和相关酶类参与动脉斑块的形成[2]。研究显示，巨噬细胞自噬在抑制斑块早期形成、维持斑块后期稳定等方面具有双重保护作用[3]。自噬是广泛存在于真核细胞中的一种程序化降解机制，上调自噬相关基因5(ATG-5)蛋白的表达后，巨噬细胞通过自噬降解胞内胆固醇等的能力大大提高，有利于阻止巨噬细胞泡沫化的发生[4]。除了ATG-5以外，ATG-7也是激活巨噬细胞自噬的核心蛋白，可与ATG-5形成复合物，一方面参与自噬体的形成，另一方面促使微管相关蛋白1轻链3(LC-3)转化为成熟的自噬体膜蛋白[5]。因此血清中ATG-5和ATG-7水平是反映细胞自噬功能的关键指标[6]。本研究通过探讨血清自噬相关因子ATG-5、ATG-7与冠心病患者冠状动脉病变严重程度、心率变异性(HRV)以及斑块易损性的关系，为寻找有临床应用价值的分子靶点提供新的思路和试验依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

2018年1月—2019年6月因不明原因胸痛在我院心血管内科进行冠状动脉造影(CAG)检查的患者248例，男134例，女114例；年龄33～85岁，平均年龄(64.93±12.34)岁。患者符合冠心病的诊断标准[7]。将所有患者分为冠心病组(左冠状动脉的左前降支、右回旋支、右冠状动脉及其主要分支中至少有1支血管腔狭窄程度≥50%)200例和对照组(CAG检查未发现异常)48例。其中冠心病组又分为稳定型心绞痛组(SAP组)125例和急性冠状动脉综合征组(ACS组)75例。根据Gensini评分系统[8]，将冠心病组患者分为轻度病变(Gensini评分0～30)组94例，中度病变(Gensini评分31～60)组59例，重度病变(Gensini评分>60)组47例。所有受检对象均排除脑血管疾病、急(慢)性感染、器质性心脏病、严重肝肾功能不全、恶性肿瘤、神经退行性疾病、代谢系统疾病以及长期大量吸烟、饮酒和滥用药物等。本研究获我院伦理委员会审查通过，且所有受试对象均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1血清中ATG-5、ATG-7水平检测 采集受试者空腹肘静脉血，ELISA法检测血清中ATG-5和ATG-7水平。试剂盒购自美国Sigma公司。

1.2.2外周血单个核细胞的提取与ATG-5、ATG-7蛋白的检测 采集每位受试者的动脉血15 mL，采用密度梯度离心法分离单个核细胞，然后收集于离心管中，加入RIPA细胞裂解液，提取总蛋白。采用Western blot法检测单个核细胞中ATG-5、ATG-7蛋白的表达水平。ATG-5、ATG-7抗体购自北京中杉金桥生物科技有限公司，按照1∶100比例稀释。

1.2.3HRV指标的检测 冠心病患者采用12导动态心电图仪(TLC5000型，德国CONTEC公司)进行24 h动态心电图检查，包括时阈参数：全部R-R间期的标准差(SDNN)、正常相邻每5 min R-R间期均数标准差(SDANN)、正常相邻R-R间期的均方根值(RMSSD)、正常相邻间期差值>50 ms的心搏数占总心搏数的百分比(pNN50)；频域参数为0.14～0.30 Hz低频(LF)以及0.15～0.40 Hz高频(HF)，并计算LF/HF比值。

1.3 血管内超声检查

采用血管内超声仪(美国Boston Scientific公司)探查冠心病患者斑块远端、近端图像，板块类型分为脂质性斑块(低回声或无回声)、纤维性斑块(回声强度与外膜组织相似)、钙化性斑块(强回声，伴有斑块后方声影)、混合性斑块(综合上述多种回声特征)。若血管腔内出现呈层状、叶状或闪亮的斑点状低回声图像则判断为血栓。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 冠心病组和对照组血清中ATG-5、ATG-7水平比较

冠心病组患者血清中ATG-5和ATG-7水平显著高于对照组，差异有显著性(Z=17.154、25.845，P<0.05)。见表1。

表1 两组受试对象血清中ATG-5、ATG-7水平比较[ρ/μg·L-1，M(P25，P75)]

2.2 不同冠状动脉病变程度冠心病患者HRV指标及血清中ATG-5、ATG-7表达的比较

轻度、中度以及重度组患者SDNN、SDANN、RMSSD、pNN50、LF/HF及血清中ATG-5和ATG-7水平比较，差异均具有显著意义(F/Z=13.261～363.795,P<0.05)。且病变程度越严重，SDNN、SDANN、pNN50以及LF/HF比值越低，同时血清中ATG-5和ATG-7水平越高。见表2。

2.3 冠心病患者HRV指标与血清中ATG-5和ATG-7表达的相关性

Pearson相关性分析显示，冠心病患者血清中ATG-5和ATG-7水平与SDNN、SDANN、pNN50值呈负相关性(r=-0.489～-0.172，P<0.05)。另外血清中ATG-7水平与RMSSD值也呈负相关性(r=-0.212，P<0.05)。

2.4 SAP组和ACS组患者外周血血清和单个核细胞中ATG-5、ATG-7水平比较

ACS组患者血清中ATG-5以及ATG-7水平明显高于SAP组患者(Z=11.089～33.127，P<0.05)。ACS组患者单个核细胞中ATG-5和ATG-7水平均明显低于SAP组患者(t=10.598、15.351，P<0.05)。见表3。

2.5 SAP组患者和ACS组患者血管内超声检查结果比较

经血管内超声检查，SAP组患者主要以纤维性斑块为主，而ACS组患者则以脂质性斑块为主，两组患者纤维性斑块、脂质性斑块类型比例比较，差异具有显著意义(χ2=18.949、28.020，P<0.05)。另外ACS组斑块破裂患者的比例明显高于SAP组，差异有显著统计学意义(χ2=18.049，P<0.05)。见表4。

3 讨 论

冠状动脉粥样硬化是冠心病的病理基础，其中巨噬细胞转化为泡沫细胞是病变斑块形成的关键环节[9-11]。因此减少易损斑块中巨噬细胞的浸润，增加斑块的稳定性也是目前临床上治疗冠心病的重要目的之一[12]。众多研究证实，自噬在心血管疾病发生、发展过程中的作用不可忽视[13-15]。自噬是真核细胞中普遍存在的一种维持细胞稳态和代谢平衡的重要过程，其发生机制复杂，目前尚未完全解码细胞自噬的整个过程，因此关于自噬与心血管疾病的关系一直停留在临床前研究阶段，尚未有可靠的研究成果应用于临床。本研究希望能为自噬相关分子应用于临床提供新的思路。

自噬分为大自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬，其中以大自噬研究最为成熟[16]。在病理条件下，一些细胞因子可诱导血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞等启动自噬过程[17]。当低密度脂蛋白通过受体及非受体途径进入内皮下后发生氧化，长期暴露于氧化低密度脂蛋白环境中的血管内皮细胞自噬明显增加，同时激活巨噬细胞形成泡沫细胞，加重坏死物质的产生及继发性炎症反应[18-19]。本研究中冠心病组患者血清中自噬相关因子ATG-5以及ATG-7水平高于对照组，并且随着冠状动脉病变严重程度的加重，患者血清中ATG-5以及ATG-7水平也随之增高。

除了根据Gensini评分评估冠状动脉病变程度以外，HRV也是定量评估心肌功能和状态的重要指标[20]，主要用于反应自主神经系统对心功能的调节能力以及交感神经与迷走神经的平衡性。相较于CAG检查，HRV检查具有无创、成本低等优势，更适用于冠心病早期评估[21]。本研究结果显示，冠心病患者HRV指标与冠状动脉严重程度和Gensini评分均有密切相关性，Pearson相关性分析显示，冠心病患者血清中ATG-5以及ATG-7的水平与SDNN、SDANN、pNN50值呈负关，与Gensini评分呈正相关。另外血清ATG-7水平与RMSSD值也呈负相关。说明HRV在一定程度上可反应患者冠状动脉病变程度。而且血清中ATG-5、ATG-7水平与心率变异性存在一定的关联，说明自噬贯穿于冠心病发生、发展的整个过程，但是在各个阶段发挥的作用和具体机制尚需进一步研究。

表2 不同冠状动脉病变程度患者HRV指标、血清中ATG-5和ATG-7水平比较

表3 SAP组和ACS组患者外周血血清和单个核细胞中ATG-5、ATG-7水平比较(ρ/μg·L-1)

表4 SAP组和ACS组患者冠状动脉病变狭窄处斑块类型比较(例(χ/%))

另外本研究结果亦显示出，ACS组患者血清中ATG-5、ATG-7水平明显高于SAP组，但是单个核细胞中ATG-5、ATG-7蛋白表达水平却低于SAP组。这可能是由于ACS以不稳定性斑块为主，当血管内皮受损后，内皮细胞的自噬性死亡易于发生斑块破裂及血栓形成。过度的平滑肌自噬也会导致平滑肌细胞的自噬性死亡，斑块中胶原纤维合成减少，从而导致纤维帽变薄，最终增加斑块的不稳定，因而血清中由内皮细胞和血管平滑肌细胞分泌的ATG-5、ATG-7蛋白分子明显增加[22]。但是巨噬细胞自噬不足可导致胆固醇流出减少，脂质过载的泡沫细胞大量凋亡并难以清除，斑块中脂质含量显著增加，进而加重动脉粥样硬化斑块的不稳定[23]，因此ACS组患者单个核细胞中ATG-5、ATG-7蛋白表达量明显降低。

综上所述，自噬在冠心病发生、发展过程中具有两面性，一方面可通过参与血管内皮损伤、调节血管平滑肌细胞表型转化等促进冠状动脉病变的加重，同时还可以通过抑制单个核细胞泡沫细胞的形成增加斑块的稳定性。本研究也从自噬角度提示血清中ATG-5、ATG-7在冠心病发生、发展过程中都扮演着重要角色，冠心病患者血清中ATG-5和ATG-7水平越高，病变程度越严重，HRV越低；另外，虽然ACS组患者血清中ATG-5、ATG-7水平高于SAP组患者，但是单个核细胞中ATG-5、ATG-7蛋白表达却低于SAP组患者，说明在冠心病患者血清中ATG-5和ATG-7水平与冠状动脉病变程度以及HRV有一定关联；而单个核细胞中ATG-5、ATG-7蛋白表达降低可能是降低ACS患者斑块稳定性的重要机制。因此增加单个核细胞自噬对于稳定易损斑块可能有一定的作用，但是由于自噬作用机制十分复杂，还需进行更进一步的研究加以探讨。